王 玉 綜述 劉志紅 審校

2001-02-12參與人類基因組計劃的美國、日本、德國、法國、英國及中國的科學(xué)家們聯(lián)合公布了人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果，意味著后基因組時代的到來，生命科學(xué)轉(zhuǎn)向?qū)蚬δ艿年U釋。由于mRNA的交替剪接、編輯或翻譯起始與終止位點的變化及翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾等機制的存在，基因表達與蛋白質(zhì)水平兩者并不完全一致。由于蛋白質(zhì)才是生命活動的具體執(zhí)行者，后基因組時代仍以蛋白質(zhì)為研究對象，才能實現(xiàn)對生命活動的完整認識。1994年，Wilkins等［1］首先提出了蛋白質(zhì)組的概念。目前將蛋白質(zhì)組定義為一個基因組、一個細胞或一種生物體所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)則以蛋白質(zhì)組為研究對象，分析蛋白質(zhì)組成成分、表達水平與修飾狀態(tài)的動態(tài)變化，闡明蛋白質(zhì)之間的相互作用及在整體水平上研究蛋白質(zhì)組成與調(diào)控的活動規(guī)律。

近年來，由于質(zhì)譜靈敏度和速度的大大提升，復(fù)雜蛋白質(zhì)組質(zhì)譜前預(yù)處理技術(shù)(高豐度蛋白的去除及胰酶酶切的引入)的逐漸建立，各種標記或非標記定量技術(shù)層出不窮，極大提升了蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于臨床疾病研究的主要任務(wù)是尋找與疾病診斷、預(yù)后、提示藥物療效和不良反應(yīng)的標志物，探尋疾病發(fā)病機制和病理生理過程。目前蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤、心血管疾病、腎臟疾病等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，本文對其相關(guān)進展做一綜述。

蛋白質(zhì)組學(xué)概述

蛋白質(zhì)組學(xué)常用技術(shù)

質(zhì)譜法 通過質(zhì)譜測定樣品離子的質(zhì)荷比(m/z)進行成分和結(jié)構(gòu)分析，常用生物質(zhì)譜技術(shù)有以下3種：(1)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)；(2)電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)；(3)串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)。質(zhì)譜法首先需要分離蛋白質(zhì)，雙向凝膠電泳(2-DE)可根據(jù)等電點和分子量的不同，區(qū)分一個樣品中的數(shù)千種蛋白質(zhì)，是最常用和最有效的蛋白質(zhì)分離技術(shù)。2-DE對極酸或極堿、高分子質(zhì)量、低豐度、疏水性和極難溶性蛋白質(zhì)的分辨率較低，目前二維或多維色譜分離技術(shù)(LC)、二維毛細管電泳(CE)和液相色譜-毛細管電泳(LC-CE)等新型分離技術(shù)有補充和取代2-DE的趨勢。

蛋白質(zhì)芯片法 通過模仿基因芯片，檢測與芯片發(fā)生結(jié)合的蛋白質(zhì)，進行蛋白質(zhì)功能研究、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究及某些疾病的診斷或治療方面的研究［2］。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué) 通過對兩個或幾個組研究對象進行比較，尋找顯著差異點。常選用質(zhì)譜研究法，雖可能發(fā)現(xiàn)某種新的潛在標志物，但并非以假設(shè)為基礎(chǔ)，是類似大海撈針的實驗技術(shù)。

目標蛋白質(zhì)組學(xué) 運用ELISA或蛋白質(zhì)芯片對前期研究發(fā)現(xiàn)的標志物進行針對性分析，最近也有使用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)質(zhì)譜對某個特定蛋白質(zhì)群進行靶向研究的報道［3］，這類技術(shù)特別適用于檢測某種特定蛋白質(zhì)的表達水平及變化，但不適于尋找與某種病理生理過程相關(guān)的新標志物。

目前常用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究路線是首先通過發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)尋找候選標志物，再通過目標蛋白質(zhì)組學(xué)進行驗證(圖 1)［4］。

圖1 蛋白質(zhì)組學(xué)尋找標志物流程圖：發(fā)現(xiàn)、驗證及應(yīng)用［4］

蛋白質(zhì)組學(xué)與腫瘤

胰腺癌 胰腺癌是一種高致死率和高侵襲性疾病，患者平均生存時間不足6月。Rong等［5］使用免疫吸附技術(shù)去除高豐度蛋白，采取2D-DIGE/MS分析5例胰腺癌和5例對照患者血清發(fā)現(xiàn)16種差異表達蛋白。運用Western Blot在16例患者中進行驗證發(fā)現(xiàn)，甘露糖結(jié)合凝集素1和肌球蛋白輕鏈激酶2為潛在診斷標記物。Fiedler等［6］收集了40例胰腺癌患者和40例對照血清，使用特異性磁珠純化富集血清多肽后行MALDI-TOF-MS分析，外部數(shù)據(jù)驗證發(fā)現(xiàn)m/z 3884、5959能正確判斷胰腺癌的準確性分別達86.3%、97.6% ，前者結(jié)合CA199診斷胰腺癌的曲線下面積(AUC)值達1.00，MALDI-TOF/TOF-MS鑒定該多肽為血小板因子4，ELISA驗證發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌和正常人血清中表達有差異。

肝癌 小肝細胞癌(HCCs)對于手術(shù)治療反應(yīng)良好，但傳統(tǒng)應(yīng)用的早期肝癌標志物甲胎蛋白并不能很好預(yù)測小細胞肝癌。Sun等［7］收集了40例HCC患者和36例正常對照的病理切片標本［7］，進行MALDI-TOF/TOF檢測篩選候選生物標志物，再進行免疫印跡和qPCR確認。ELISA法在88個HCC患者和64個對照的血清中對以上確認的組織標志物進行驗證發(fā)現(xiàn)，體積較小(≤2 cm)HCC患者的血清波形蛋白明顯過表達，進一步研究證實波形蛋白單獨或與甲胎蛋白聯(lián)合均可作為檢測體積較小的HCCs的診斷標記物。Yeo等［8］對HCC患者癌組織及癌旁正常組織進行基于二維凝膠電泳的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，六種外源酶在腫瘤組織中表達明顯下調(diào)，其中苯酚磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase，SULT1A1)在Western Blot驗證中得到確認，進一步研究發(fā)現(xiàn)，SULT1A1的下調(diào)與國際抗癌聯(lián)盟分期及血清甲胎蛋白水平密切相關(guān)。SULT1A1可能成為篩查早期HCC的生物標記物，并有助于預(yù)測HCC的臨床療效。

卵巢癌 有研究聯(lián)合蛋白質(zhì)芯片/SELDI-TOFMS在血清中尋找卵巢癌早期診斷標志物，發(fā)現(xiàn)三種差異表達蛋白：載脂蛋白A1(APOA1)、甲狀腺轉(zhuǎn)運蛋白和人類間α胰蛋白酶H4重鏈。此三種標志物聯(lián)合CA125診斷早期卵巢癌的敏感度、特異度均優(yōu)于CA125單獨應(yīng)用。研究者將該研究進一步深化，研發(fā)了一種卵巢腫瘤的分流方法OVA1TM，最近已獲美國食品及藥品管理局(FDA)批準。當(dāng)與臨床評估(如影像和體格檢查)聯(lián)合時，這一基于免疫測定的分析方法(包括 β2微球蛋白、APOA1、CA125、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)甲蛋白)在惡性腫瘤高危女性人群中具有陽性預(yù)測價值。OVA1評分可幫助醫(yī)師決定惡性腫瘤高?；颊呤欠窨蓮霓D(zhuǎn)診至婦科腫瘤治療中獲益［9］。該試劑盒得到FDA的批準是蛋白質(zhì)組學(xué)尋找標志物從實驗室走向臨床進程中的一個標志性成果。該研究也提示面對一種復(fù)雜疾病，單一標志物并不能取得很好的區(qū)分效果，聯(lián)合多種標志物可能會獲得更好的敏感度和特異度。

膀胱癌 發(fā)現(xiàn)候選標志物只是尋找疾病相關(guān)標志物的第一步，候選標志物的驗證和確認才是尋找標志物的核心。在前期研究中，Moreira等［10］已發(fā)現(xiàn)膀胱癌相關(guān)蛋白(BLCAP)在疾病組和對照組表達有差異。作為一種新蛋白，BLCAP的結(jié)構(gòu)、功能及細胞定位均未知。該作者通過二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)預(yù)測其結(jié)構(gòu)，并制作相應(yīng)抗體，通過免疫組化明確其細胞定位發(fā)現(xiàn)，BLCAP高表達預(yù)示著患者預(yù)后不良，提示此蛋白染色模式的分類可能具有預(yù)后價值。而且，與單一標記物相比，聯(lián)合BLCAP及脂肪細胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP)與疾病分級和(或)分期的相關(guān)度更為密切。

肺癌 肺癌是導(dǎo)致死亡最常見的腫瘤，目前對其發(fā)病機制仍了解甚少。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進步使我們在蛋白質(zhì)水平上對肺癌發(fā)病機制有更深入的了解。Kikuchi等［3］聯(lián)用等電聚焦(IEF)和非標記定量LC-MS對腺癌、鱗癌、正常對照三組進行深入分析發(fā)現(xiàn)，3621個蛋白，鑒別出多種與疾病有關(guān)的新的信號通路和差異蛋白，液相-多反應(yīng)性監(jiān)測質(zhì)譜(LC-MRM-MS)和免疫組化對以上新發(fā)現(xiàn)進行了驗證。為進一步將組織分析中發(fā)現(xiàn)的差異蛋白轉(zhuǎn)化血清中疾病的早期診斷標準物，作者運用ELISA對其中部分差異蛋白在血液中表達水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，鱗癌患者血漿內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)較對照組明顯升高。

蛋白質(zhì)組學(xué)與心血管疾病

動脈粥樣硬化 低水平的高密度脂蛋白(HDL)是動脈粥樣硬化的危險因素之一，HDL通過促使膽固醇從外周返回肝臟而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，但其具體機制尚不清楚。Vaisar等［11］使用LC-MS/MS分析了正常人和冠心病患者(CAD)外周血HDL的差別發(fā)現(xiàn)，正常人外周血HDL中含有多種補體調(diào)節(jié)蛋白、色氨酸蛋白酶抑制劑及急性時相蛋白，提示正常人HDL或參與固有免疫，通過抑制炎癥和抑制色氨酸蛋白酶參與心臟保護，而CAD患者高密度脂蛋白3(HDL3)內(nèi)ApoE水平明顯升高，另一組獨立隊列驗證了這一發(fā)現(xiàn)，提示ApoE有可能成為動脈粥樣硬化診斷標志物。

肺動脈高壓 肺動脈高壓(PH)預(yù)后極差，其特征性病理改變?yōu)榉蝿用}重塑導(dǎo)致肺小動脈變窄，但對其病因及發(fā)病機制仍了解甚少。Kwapis-zewska等［12］認為在疾病早期可能存在某些觸發(fā)因素，缺氧是導(dǎo)致PH重要原因之一，研究者將來自缺氧1d小鼠的肺臟與不缺氧小鼠的肺臟進行2DE/MALDITOF-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)分析。發(fā)現(xiàn)多種差異蛋白，其中參與肌肉生成的Fhl-1最受關(guān)注，該蛋白在缺氧小鼠明顯升高。之后又運用免疫組化、Western Blot在多種PH模型及人類特發(fā)性肺動脈高壓(IPAH)標本進行驗證。為進一步探討Fhl-1的分子機制，敲除了HIF的基因，發(fā)現(xiàn)Fhl-1的調(diào)節(jié)是HIF依賴的。敲除Fhl-1或過表達Fhl-1，可抑制或促進人類平滑肌細胞增生、遷移。免疫共沉淀聯(lián)合MALDI-TOF-MS發(fā)現(xiàn)Talin1是一種新的Fhl-1的共作用蛋白。

腹主動脈瘤 腹主動脈瘤病理表現(xiàn)細胞外基質(zhì)的病理性重塑，目前對其發(fā)生發(fā)展的病理生理機制了解甚少。Didangelos等［13］開發(fā)了一種新的亞蛋白質(zhì)組分離方法，可選擇性分離細胞外基質(zhì)，包括新合成的細胞外基質(zhì)蛋白和降解產(chǎn)物。采用SDS電泳分離蛋白質(zhì)混合物，非標記液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析蛋白質(zhì)成分發(fā)現(xiàn)，多種細胞外基質(zhì)蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶12(MMP-12)在腹主動脈瘤組和對照組存在差別。將正常主動脈組織與MMP-12共孵育后，發(fā)現(xiàn)多種新的MMP-12作用底物。

蛋白質(zhì)組學(xué)與腎臟疾病

慢性腎臟病(CKD) Good等［14］使用超濾去除尿液中的大分子量蛋白，運用毛細管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)分析了230例不同病因CKD患者、379例正常人和非腎臟病患者尿液中的小分子量多肽，發(fā)現(xiàn)634個潛在標志物，并通過序列分析鑒定出273個。使用支持向量機(SVM)對這273個標志物進行編排組合，發(fā)現(xiàn)了一種特異的尿液標志物組合，隨后的另一組獨立樣本證實這個標志物組合診斷CKD的敏感度是85.5%，特異度是100%。

糖尿病腎病 糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的重要病因之一，據(jù)估計約1/3的糖尿病微量蛋白尿患者會出現(xiàn)早期腎功能惡化(ERFD)。Merchant等［15］隨訪了一組微量蛋白尿、無腎功能損害的1型糖尿病腎病患者，隨訪10～12年，將其分為ERFD組(21例)和非ERFD組(40例)。運用LC/MALDI-TOF-MS對樣本中小分子量蛋白質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)，ERFD組黏蛋白Ⅹ、α1(IV)膠原和 α1(V)膠原3種蛋白質(zhì)表達下調(diào)，5磷酸肌醇2激酶、閉鎖小帶3和FAT腫瘤抑制因子2等3種蛋白質(zhì)表達上調(diào)。對腎組織標本進行免疫組化分析發(fā)現(xiàn)5磷酸肌醇2激酶和閉鎖小帶3在早期1型糖尿病腎病患者腎組織內(nèi)表達較正常對照上調(diào)。提示這兩種蛋白可能成為1型糖尿病腎病ERFD潛在的診斷標志物。

IgA腎病 IgA腎病是我國最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，也是ESRD常見原因之一。IgA腎病蛋白尿常用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)類藥物治療，但患者對治療反應(yīng)性各不相同，Rocchetti等［16］使用2DE/LC-MS/MS分析了18例接受ACEI治療的IgA腎病患者和20例健康對照的尿液標本發(fā)現(xiàn)，激肽原、人類間α胰蛋白酶H4重鏈和甲狀腺轉(zhuǎn)運蛋白3種蛋白在ACEI有效組和無效組含量有差異。Western Blot發(fā)現(xiàn)ACEI有效組與無效組治療前后尿液緩激肽表達差異明顯，無效組緩激肽明顯低于有效組，提示尿液緩激肽水平可預(yù)測ACEI治療IgA腎病的療效。

狼瘡性腎炎 狼瘡性腎炎是一種常見的繼發(fā)性腎臟疾病，其病程遷延，易復(fù)發(fā)，目前除腎活檢組織病理檢查，尚無可靠且方便判斷狼瘡腎炎活動的指標。Somparn等［17］運用2DE/TOF-TOF-MS/MS分析5例活動性狼瘡和5例緩解期狼瘡患者的尿液，發(fā)現(xiàn)16種差異蛋白。運用ELISA對鋅α2糖蛋白和前列腺素H2-D異構(gòu)酶(PGDS)進行驗證發(fā)現(xiàn)，鋅α2糖蛋白在活動性、非活動性狼瘡患者尿液中均升高，而PGDS僅在活動性狼瘡患者尿液中升高，提示后者更適合用于判斷狼瘡的活動程度。

系統(tǒng)性血管炎 目前系統(tǒng)性血管炎已有標準的治療方案，但缺少監(jiān)測治療反應(yīng)的標志物。Haubitz等［18］運用CE-MS分析活動性腎血管炎患者、健康人、其他腎臟病患者、非腎臟病患者及緩解期腎血管炎患者的尿液標本發(fā)現(xiàn)，122種多肽有顯著性差異，其中47種通過質(zhì)譜測序鑒定，運用SVM和線性模型對這47種標志物進行組合發(fā)現(xiàn)，二種模型區(qū)分活動性和緩解期血管炎的敏感度和特異度都為100%。對10例活動性AAV患者接受免疫抑制治療治療前、治療后1、3、6月的尿液標本進行動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，這47種標志物隨著病情的緩解發(fā)生顯著變化。

致密物沉積病(DDD) DDD以往稱為膜增生性腎炎Ⅱ型，病理表現(xiàn)基膜增厚，細胞增生，系膜基質(zhì)擴張，其最特征性表現(xiàn)基膜致密層內(nèi)電子致密物沉積。DDD發(fā)病源于補體旁路途徑的異常激活，但目前還不清楚基膜沉積電子致密物的具體成分。Sethi等［19］運用顯微切割技術(shù)從甲醛固定、石蠟包埋的組織中分離出2個腎小球，運用LC-MS進行分析。研究囊括了8例DDD患者，5例正常對照，9例免疫復(fù)合物性膜增生性腎小球腎炎患者，分析發(fā)現(xiàn)，DDD患者腎小球內(nèi)補體末端成分C5、C6、C7、C8含量明顯升高，提示DDD的發(fā)病與補體的異常激活有關(guān)之外，還可能由補體終末產(chǎn)物的過度形成介導(dǎo)。抑制補體終末產(chǎn)物的過度形成可能為DDD的治療帶來新的方向。

特發(fā)性膜性腎病(IMN) IMN是一種器官特異性的自身免疫病，但長期以來我們并不清楚在人類體內(nèi)其靶抗原是什么。2009年 Beck等［20］運用Western Blot聯(lián)用LC-MS發(fā)現(xiàn)多數(shù)IMN患者血清內(nèi)存在針對M型磷脂酶A2受體(PLA2R)的抗體，提示PLA2R是IMN的主要靶抗原，為其研究揭開新篇章［20］。最近 Bruschi等［21］提取顯微切割下的腎小球內(nèi)的IgG，運用2DE/LC-MS/MS進行鑒定，發(fā)現(xiàn)IMN患者腎小球內(nèi)存在針對α烯醇化酶的抗體，Western Blot在131例IMN血清中進行驗證發(fā)現(xiàn)該抗體在1/4患者體內(nèi)有表達。

小結(jié)：蛋白質(zhì)組學(xué)作為功能基因組學(xué)的重要組成成分，近十年獲得了迅速發(fā)展，同時也在面臨著質(zhì)疑——即發(fā)表了很多文章，發(fā)現(xiàn)了很多標志物，卻很少有標志物進入臨床。要完成蛋白質(zhì)組學(xué)研究的臨床轉(zhuǎn)化還有很多技術(shù)瓶頸需要攻克。為了解決目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對分散，缺少統(tǒng)一的處理流程和標準化方案的問題，歐洲腎臟和尿蛋白質(zhì)組學(xué)組織(European kidney and urine proteomics，EuroKUP)及人類腎臟和尿蛋白質(zhì)工程(human kidney and urine proteome project，HKUPP)，制定了標準化的尿液收集及儲存方案，促進了尿蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展［22］。蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展到今天，人們越來越清楚地認識到如果說組學(xué)的應(yīng)用是發(fā)現(xiàn)科學(xué)的開始，那么其驗證則離不開經(jīng)典生物學(xué)方法。只有將蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)現(xiàn)與疾病的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系起來才能將其成果轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中。

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