劉魁，馮凱，王萍，賈海英，任家庭，路浩軍，彭文鴻

水通道蛋白-5基因多態(tài)性與中國北方漢族人群慢性阻塞性肺疾病的相關性分析

劉魁，馮凱，王萍，賈海英，任家庭，路浩軍，彭文鴻

目的探討水通道蛋白-5(AQP5)基因多態(tài)性與中國北方漢族人群慢性阻塞性肺疾病(COPD)的遺傳易感性及嚴重程度的關系。方法2007年6月－2012年5月在解放軍306醫(yī)院呼吸科獲得診斷的COPD急性加重(AECOPD)患者220例，男142例，女78例，年齡37～101(74.0±10.0)歲，選取在我院進行體檢，且年齡、性別與COPD患者相匹配的285例健康人群列入對照組，男183例，女102例，年齡44～97(72.5±8.6)歲。將COPD組分為4個亞組：第1秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)＜70%，第1秒用力呼氣肺容積占計值百分比(FEV1%)≥80%為輕度組；50%≤FEV1%＜80%為中度組；30%≤FEV1＜50%為重度組；FEV1≤30%為極重度組，將輕度與中度合并為輕-中度組，重度與極重度合并為重度-極重度組。搜集研究對象外周血標本，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)和SNaPshot法檢測AQP5基因3個標簽單核苷酸多態(tài)性(tSNP)位點(rs3736309，rs296754和rs296759)的基因型分布。采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，用非條件logistic回歸模型計算比數(shù)比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)。比較AQP5 3個tSNP基因型頻率分布在健康對照組和COPD患者間的差異，以明確AQP5基因多態(tài)性與中國北方漢族人群罹患COPD的相關性。比較輕-中度與重度-極重度COPD患者AQP5基因多態(tài)性的差異，以進一步明確AQP5基因多態(tài)性與COPD嚴重程度的關系。結果AQP5基因rs3736309、rs296754和rs296759位點基因型分布在COPD患者與對照組中無明顯差異。但在COPD患者中，rs3736309在輕-中度與重度-極重度患者中基因型分布的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示rs3736309多態(tài)性位點可能與COPD患者氣道阻塞嚴重程度相關。結論AQP5基因多態(tài)性與COPD的易感性無關，但與COPD的肺功能損害嚴重程度有關。

肺疾病，慢性阻塞性；水通道蛋白-5；多態(tài)性，單核苷酸

慢性阻塞性肺疾病(ch ron ic obstru c tive pulmonary disease，COPD)是一種以氣流受限持續(xù)存在且呈進行性發(fā)展為特征的慢性疾病，發(fā)病率和病死率在全世界范圍內(nèi)都逐年升高[1-2]。COPD的發(fā)病除與吸煙、環(huán)境污染等因素有關外，與多種基因的遺傳易感性也有關[3-5]。水通道蛋白-5(aquaporin5，AQP5)是一種轉運水分子的跨膜結合蛋白，主要參與水的轉運，維持細胞內(nèi)外水平衡，并參與調節(jié)肺臟黏液、唾液分泌以及淚液的產(chǎn)生，與肺功能密切相關。本研究以AQP5為候選基因，采用標簽單核苷酸多態(tài)性(tag single nucleotide polymorphism，tSNP)的方法對其進行關聯(lián)研究，以探討AQP5基因多態(tài)性與COPD遺傳易感性及疾病嚴重程度的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 搜集2007年6月－2012年5月在解放軍306醫(yī)院呼吸科住院治療的COPD急性加重(acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)患者的外周血樣本。其中COPD組220例，男142例，女78例，年齡37～101(74.0±10.0)歲，診斷符合COPD最新診治指南[1]。對照組為在我院進行體檢且年齡、性別與COPD患者相匹配的健康人群，共285例，男183例，女102例，無心、肺、腦、肝、腎等重大疾病，年齡44～97(72.5±8.6)歲。將COPD組根據(jù)肺功能測試結果將氣道受限的嚴重程度分為4個亞組：第1秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比(FEV1/ FVC)＜70%，第1秒用力呼氣肺容積占計值百分比(FEV1%)≥80%為輕度組；50%≤FEV1%＜80%為中度組；30%≤FEV1＜50%為重度組；FEV1≤30%為極重度組[1]。在后續(xù)分析時將輕度組與中度組合并為輕-中度組，將重度和極重度組合并為重度-極重度組。所有參與者均簽署知情同意書，經(jīng)解放軍306醫(yī)院倫理委員會認可。

1.2材料方法

1.2.1標本獲取 于次日抽取所有入選患者外周靜脈血2m l，用于提取基因組DNA。

1.2.2DNA提取 采用酚-氯仿法從患者外周血中提取基因組DNA，于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3tSNP選擇 參考序列取自人類單體型計劃數(shù)據(jù)庫(Chr12：48639886－48650885)，共11kb，包括AQP5的5'區(qū)、全部3個外顯子區(qū)、4個內(nèi)含子區(qū)和少量3'區(qū)。這一區(qū)域的dbSNP共8個(http://snp. cshl.org/cgi-perl/gbrowse/hapmap24_B36/)，采取Tag SNP Picker程序確定rs3736309(S1)、rs296754(S2)和rs296759(S3)作為tSNP用于基因型分析，參數(shù)為r2大于0.8，最小等位基因頻率(MAF)大于0.05。

1.2.4基因型分析 rs3736309基因型分析采用限制性片段長度多態(tài)性法，以Prim e3軟件設計引物[生物工程(上海)股份有限公司合成]，P1'為5'-ATTCTGTGGGAGTGGACCAG-3'，P2'為5'-GGTTCAGGCCATACAAAGC-3'，擴增長度為341bp。PCR反應體系(25μl)：25ng基因組DNA，dNTP(各10mmol/L)，10×緩沖液，引物各5pmol，E×TaqDNA聚合酶1U，以上試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR條件：94℃預變性5m in；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；最后72℃ 延伸7m in，4℃保存。以上反應在基因擴增儀(PE 9700型，ABI公司)上進行。PCR產(chǎn)物用XbaI內(nèi)切酶(Promege公司)酶解，酶切產(chǎn)物(245bp和106bp)行瓊脂糖凝膠電泳，并于紫外透視儀上觀察電泳條帶，判斷基因型。分型結果經(jīng)直接測序法加以驗證(北京三博遠志生物技術公司)。

rs296754和rs296759基因型分析采用SNaPshot技術進行(北京閱微基因技術公司)。以Prim ier 3軟件設計引物及延伸引物。rs296759預擴增引物：正義GTGTGGGTTTCTATTAACACGACT；反義TATCTGCAAAACAGGGGTACTT；延伸引物為ttttt tttttTCGTGAGGAGAAAATGAGACCA；rs296754預擴增引物，正義GGACGAATATACTGACACACCAC T；反義GTGTCCCCTCTGAAGGTTTATT。延伸引物為tttttttttttttTAGACCCTCAAAGAAGGCAAAC。

預擴增PCR反應和擴增產(chǎn)物純化：PCR反應體系10μl，包括10×緩沖液1μl，0.2μl dNTP混合物(10mmol/L)，0.1μl HotstarTaqDNA聚合酶(5U/μl,KAPAbiosystems公司)，PCR引物(10pmol/L)各0.2μl和1μl DNA模板(20mg/L)。反應程序：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，32個循環(huán)；72℃8m in，結束后4℃保存。PCR擴增后，取PCR反應產(chǎn)物2μl行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物純化：每個樣本取預擴增產(chǎn)物3μl，共15μl混勻，加入5U SAP(Fermentas公司)和2UExoⅠ(NEB公司)，震蕩混勻，37℃保溫1h，然后75℃保溫15m in滅活SAP和ExoⅠ酶。

SNaPshot反應：取純化好的PCR產(chǎn)物1μl，每條濃度為0.2μm ol/L的延伸反應引物混合物，與Ready Reaction M ix (含AmpliTaqDNA多聚酶和不同熒光標記的ddNTP)組成一個10μl PCR反應體系。反應程序：96℃變性10s；96℃變性10s，50℃退火5s，60℃延伸30s，27個循環(huán)；60℃延伸30s，結束后4℃保存。延伸產(chǎn)物純化：在10μl延伸產(chǎn)物中加入1U SAP，37℃溫浴1h，75℃滅活15min。

DNA測序儀測序：在96孔板中每孔加入9μl高純甲酰胺(Hi-Di Formam ide)，0.5μl分子量內(nèi)標GeneScan-120 LIZ Size Standard(ABI公司)和0.5μl純化的延伸產(chǎn)物，總體積10μl。95℃變性3m in后，在DNA序列檢測儀(3730XL型，ABI公司)上進行毛細管電泳，采用GeneMapper 4.0軟件分析實驗結果。為保證結果準確性，隨機抽取5%樣本進行直接測序驗證SNaPshot方法的準確性。

1.3研究指標 搜集患者的一般情況和基因分析結果，對兩組的基線指標[年齡、性別構成比、體重指數(shù)、吸煙人數(shù)的構成比、吸煙指數(shù)和病程(疾病第一次診斷到此次發(fā)病時間)]進行對比。對SNP的rs3736309(S1)、rs296754(S2)和rs296759(S3)基因型在兩組患者中的分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，以便確認基因型鑒定的準確性。為分析AQP5基因多態(tài)性與中國北方漢族人群COPD的關系，對AQP5 3個tSNP基因型頻率分布在健康對照組和COPD患者間的差異進行比較。為分析AQP5基因多態(tài)性與COPD嚴重程度的關系，對輕-中度(輕度+中度)和重度-極重度(重度+極重度)COPD患者AQP5基因多態(tài)性的差異進行比較。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析。Hardy-Weinberg平衡及計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。采用非條件logistic回歸模型計算比數(shù)比(odds ratios，OR)及95%可信區(qū)間(CI)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1一般特征 COPD組與對照組的年齡、性別構成差異無統(tǒng)計學意義。COPD組輕-中度(輕度+中度)和重度-極重度(重度+極重度)患者的一般特征比較詳見表1。對照組AQP5基因rs3736309、rs296754、rs296759基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P值分別為0.49、0.75、0.87)；COPD組rs3736309、rs296754、rs296759基因型分布也符合Hardy-Weinberg平衡(P值分別為0.25、0.25、0.38)。除COPD組1例樣本的rs296754和rs296759兩個位點未分型成功外，其余位點均分型成功。圖1、2是3例COPD患者rs3736309的電泳圖及測序峰圖，顯示了3種基因型之間的差異。

2.2AQP5基因多態(tài)性與中國北方漢族人群COPD易感性的關系 AQP5 3個tSNP基因型頻率分布在健康對照組和COPD患者間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表2)。

表1 輕-中度與重度-極重度COPD患者一般資料比較Tab.1 Comparison of features between patients with m ild-to-moderate COPD and those with severe-to-very severe COPD

2.3AQP5基因多態(tài)性與中國北方漢族人群COPD嚴重程度的關系 COPD組按嚴重程度分亞組并與AQP5 tSNP進行關聯(lián)分析，同時納入年齡因素調整OR值，發(fā)現(xiàn)rs3736309 SNP在輕-中度組與重度-極重度組基因型分布頻率和等位基因分布頻率中的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時rs3736309 tSNP呈共顯模式，表現(xiàn)為重度及極重度組高頻等位基因純合子明顯減少，低頻等位基因純合子明顯增多，雜合子變化頻率不大(表3)。

3 討 論

本研究結果表明，中國北方漢族人群AQP5基因存在明顯的基因多態(tài)性，根據(jù)人類單體型計劃數(shù)據(jù)庫公布的中國人AQP5單體型結構，本研究選擇的3個tSNP能夠代表完整的AQP5基因的單體型結構。本研究采用PCR-RFLP和SNaPshot法進行基因型分析并以抽樣直接測序法加以驗證，保證了基因分型的準確性。

圖1 酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR digested products of rs3736309 separated by 2% Agarose gel

圖2 測序峰圖與SNP rs3736309的鑒別Fig. 2 Sequence traces and SNP identification of rs3736309

表2 AQP5基因單核苷酸多態(tài)性與COPD易感性的關系Tab. 2 Correlation between AQP5 SNP and susceptibility to COPD

表3 AQP5基因多態(tài)性與COPD嚴重程度的關系Tab. 3 Correlation between AQP5 SNP and severity with COPD

既往文獻報道，AQP5參與調節(jié)黏液高分泌及黏蛋白高表達[6]，且COPD患者氣道上皮AQP5表達較對照組降低，可能與氣流阻塞的嚴重程度有關[7]。本研究在基因水平發(fā)現(xiàn)AQP5基因多態(tài)性與COPD遺傳易感性無關，而與COPD患者肺功能損害嚴重程度相關。rs3736309基因型分布頻率和等位基因分布頻率與COPD患者氣道阻塞程度明顯相關，且rs3736309 tSNP呈共顯模式，表現(xiàn)為嚴重組(重度和極重度患者)高頻等位基因純合子(A/A)明顯減少，低頻等位基因純合子(G/G)明顯增多，提示如果COPD患者基因型為G/G型，可能病情較重，疾病進展迅速。Hansel等[8]通過連續(xù)5年隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，在歐美人群中，AQP5基因多態(tài)性(rs3736309、rs296763)與持續(xù)吸煙的COPD患者肺功能下降率密切相關，并指出rs3736309的G等位基因與肺功能下降明顯相關。但該結果與Ning等[9]的研究結果不同，他們發(fā)現(xiàn)中國西北漢族人群的AQP5 rs3736309與COPD患病呈負相關，G等位基因是其保護性因素。

rs3736309位于AQP5第3內(nèi)含子，雖然內(nèi)含子不能直接轉錄編碼，但對轉錄和翻譯過程起調控作用，此外，內(nèi)含子還可參與維護不成熟信使RNA(前基因)的二級結構[10]。因此，rs3736309最終是通過何種機制影響和改變AQP5的功能，還需進一步研究。

既往研究表明，隨著年齡增加，肺功能持續(xù)下降[11]，吸煙(包括二手煙)是COPD最主要的危險因素之一[12-14]。本研究輕-中度患者與重度-極重度患者中吸煙人數(shù)在構成比上差異無統(tǒng)計學意義，因此排除了吸煙作為一個獨立因素對疾病的影響。本研究中COPD兩個亞組間年齡水平相差顯著，輕-中度患者比重度-極重度患者的平均年齡大，這可能與醫(yī)院收治住院患者的年齡結構有關，將其作為回歸分析的矯正因子，發(fā)現(xiàn)rs3736309仍與COPD嚴重程度相關。

COPD作為一種復雜的多基因遺傳病，其性狀由多種基因多態(tài)性共同決定，同時受環(huán)境影響，其中每個易感基因可能都是微效基因。針對本研究結果，我們未來將繼續(xù)擴大樣本量，并采用多中心聯(lián)合研究方式進一步驗證。

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Relationship of the aquaporin-5 gene polymorphism with chronic obstructive pulm onary disease in Han population of north China

LIU Kui1, FENG Kai2, WANG Ping1, JIA Hai-ying3, REN Jia-ting1, LU Hao-jun2, PENG Wen-hong1*
1Department of Respiratory Medicine,2Center for Experimental Medicine,3Physical Examination Center, 306 Hospital of PLA,Beijing 100101, China
*

, E-mail: pengwenhong306@yahoo.cn

ObjectiveTo explore the relationship between aquaporin-5 (AQP5) gene polymorphism and the genetic susceptibility and clinical severity of chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in Han population of north China. MethodsTwo hundred and twenty COPD patients (142 males and 78 females, aged 37-101 (74.0±10.0) years, diagnosed in the 306 Hospital of PLA from Jun. 2007 to May 2012) were listed as the study group, and 285 healthy subjects (183 males and 102 females, aged 44-97 (72.5±8.6) years) were recruited as control group. The COPD patients with FEV1/FVC ＜70% were divided into 4 subgroups based on Post-Bronchodiflator FEV1: those with FEV1% ≥80% were assigned as m ild subgroup, patients with 50% ≤FEV1% ＜80% as in moderate subgroup, with 30% ≤FEV1% ＜50% as severe subgroup, and those with FEV1% ≤30% as very severe subgroup. Patients in mild and moderate subgroups were combined into mild-to-moderate group, and those in severe and very severe subgroups were combined into severe-to-very severe group. Three tSNPs (rs3736309, rs296754 and rs296759) of AQP5 gene were selected for genotyping by PCR-RFLP and SNaPshot analysis. Chi-square test was used to perform the Hardy-Weinberg test, and unconditional logistic regression was used to calculate the odds ratio (OR) and 95% confidence interval (CI). The genotype frequency distributionwas compared to identify relationship between AQP5 gene polymorphisms and COPD in Han population of north China. The genotype frequency distribution between m ild-to-moderate and severe-to-very severe group was compared tofurther clarify the relationship between AQP5 gene polymorphisms and the severity of COPD.ResultsThe genotype distribution of 3 tSNPs in COPD patients showed no difference from that in healthy controls. Advanced analysis performed in the COPD patients revealed that the genotype distribution of rs3736309 in m ild-to-moderate COPD patients was significantly different to that in severe-tovery severe patients (P＜0.05). The genotypes rs296754 and rs296759 were not associated with severity of airway obstruction.ConclusionThe AQP5 polymorphism is not associated with the incidence of COPD, but associated with a high risk of developing severe of COPD.

pulmonary disease, chronic obstructive; aquaporin 5; polymorphism, single nucleotide

R563.3

A

0577-7402(2013)07-0569-05

2013-03-16；

2013-05-08)

(責任編輯：沈寧)

劉魁，碩士研究生。主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的相關研究和治療

100101 北京 解放軍306醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學科(劉魁、王萍、任家庭、彭文鴻)，中心實驗室(馮凱、路浩軍)，體檢中心(賈海英)

彭文鴻，E-mail: pengwenhong306@yahoo.cn