蘆起，鐘海英，林麗華，林雅茵，楊錫強，余加林

氨溴索對銅綠假單胞菌密度感應(yīng)缺陷株生物膜細(xì)菌活力和黏附作用的影響

蘆起，鐘海英，林麗華，林雅茵，楊錫強，余加林

目的研究氨溴索對銅綠假單胞菌野生株P(guān)AO1及密度感應(yīng)缺陷株(ΔlasI ΔrhlI基因缺陷)生物膜(BF)細(xì)菌活力及早期黏附的影響。方法利用平板計數(shù)法測定不同濃度(0、1.875、3.75mg/m l)氨溴索對PAO 1菌株、ΔlasI ΔrhlI菌株生物膜菌落的清除效應(yīng)；熒光多功能酶標(biāo)儀檢測不同濃度氨溴索作用后PAO1菌株、ΔlasI ΔrhlI菌株的熒光強度，計算黏附率以反映干預(yù)對細(xì)菌黏附的影響。結(jié)果氨溴索作用后，兩種菌株的活菌生存率和黏附率均出現(xiàn)下降，ΔlasI ΔrhlI株活菌生存率較PAO 1株下降更明顯(P＜0.05)，而PAO 1株黏附率較ΔlasI ΔrhlI株下降更明顯(P＜0.05)。結(jié)論氨溴索具有拮抗密度感應(yīng)系統(tǒng)的作用，可用于抗細(xì)菌生物膜活力，為難治性銅綠假單胞菌感染的治療提供了新思路。

氨溴索；假單胞菌，銅綠；細(xì)菌黏附；群體感應(yīng)

細(xì)菌生物膜(biofilm，BF)是指細(xì)菌黏附于惰性或活性實體表面繁殖、分化并分泌大量胞外多聚基質(zhì)(exopolymeric matrix，ECM)使它們相互粘連，并將自身克隆聚集纏繞其中形成的膜狀物，人體細(xì)菌感染有65%涉及生物膜[1-2]。細(xì)菌生物膜引起的難治性感染是臨床上常見的棘手問題。銅綠假單胞菌是臨床上常見的生物膜感染的病原，如肺囊性纖維病、支氣管擴張、慢性肺膿腫、各種插管合并感染等，病程長且常遷延不愈，抗生素治療往往無法奏效[3]。氨溴索是臨床常用藥物，不僅是一種黏液溶解劑，還具有抗炎、抗氧化、抑制炎性介質(zhì)、松弛氣道平滑肌、促進肺表面物質(zhì)的合成及與其他藥物協(xié)同等作用[4-5]。細(xì)菌生物膜菌是由很多微菌落組成的群體組織，各細(xì)胞間通過嚴(yán)密的信號傳遞來交流信息，這種細(xì)胞與細(xì)胞的交流有賴于密度感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)[6]。QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)著細(xì)菌群體的多種生理功能，已成為控制BF相關(guān)感染的新靶點。本研究從細(xì)菌清除率和細(xì)菌黏附率兩個方面來研究氨溴索對銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1受試菌株、藥品及主要儀器 銅綠假單胞菌PAO 1野生株和QS系統(tǒng)缺陷株(ΔlasI Δrh lI基因缺陷)由丹麥哥本哈根大學(xué)臨床微生物系宋志軍博士饋贈。氨溴索標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號20051011)。LB培養(yǎng)基，LB瓊脂平板，PBS緩沖溶液(北京升博生物制品公司)，LIVE/ DEAD?BacLightTM細(xì)菌熒光試劑盒(美國Molecular Probes公司)。96孔熒光酶標(biāo)板(美國Corning公司)，多功能熒光酶標(biāo)儀(美國BioTek Synergy HT)，紫外分光光度計(UV-1700，蘇州島津儀器有限公司)，熒光顯微鏡(BX51，O lympus)，超聲破碎儀(JYD-150)。

1.2方法

1.2.1生物膜體外模型制備 兩種菌株單菌落分別接種于L-Broth培養(yǎng)液中，37℃、180r/min震蕩培養(yǎng)過夜。分光光度計測定菌液在600nm處的吸光度(A600)值，調(diào)整A600值至1.0。接種不同菌株菌液于預(yù)先放置無菌蓋玻片(8mm×8mm，作為BF生長載體)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1m l，37℃培養(yǎng)，隔日換液。

1.2.2平板計數(shù)法測定不同濃度氨溴索對生物膜菌落的清除作用 生物膜培養(yǎng)3d，將玻片用PBS漂洗3次后分為空白對照組(未加氨溴索)及2個不同濃度(3.75、1.875mg/m l)的氨溴索作用組。8h后，洗去浮游菌，125W超聲震蕩15m in，取10μl加入LB平板計數(shù)。

1.2.3熒光多功能酶標(biāo)儀測定不同濃度氨溴索對細(xì)胞黏附率的影響 過夜培養(yǎng)兩種銅綠假單胞菌菌株，在600nm波長處調(diào)整分光光度計的讀數(shù)至1.0，在96孔板每孔中加入菌液、不同濃度(3.75、1.875mg/m l)的氨溴索及PBS各100μl，作用4h后，以PBS洗滌3次，熒光染料SYTO9染96孔板底部細(xì)菌15m in，再以PBS洗去未結(jié)合染料，置于酶標(biāo)儀中檢測[7]。每組重復(fù)9孔。熒光多功能酶標(biāo)儀參數(shù)如下。激發(fā)光濾光片：485nm/20；發(fā)射光濾光片：525nm/20；光學(xué)位置：bottom；靈敏度：auto；每孔樣品檢測次數(shù)：12次。通過熒光強度計算細(xì)菌黏附率。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 將菌落計數(shù)取常用對數(shù)(lg)后進行分析。采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，均符合正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度氨溴索對生物膜菌落的清除效果 1.875、3.75mg/m l氨溴索作用8h后，PAO 1株存活率分別降至空白對照組的84.3%±0.3%、72.9%±0.6%，而QS系統(tǒng)缺陷株則降至空白對照組的76.1%±2%、68.8%±1%，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且QS系統(tǒng)缺陷株存活率下降較PAO1株更為明顯(P＜0.05，表1)。

表1 PAO1以及QS系統(tǒng)缺陷株生物膜中細(xì)菌存活率(%)Tab.1 Survival rate of bacteria on the biofilms of PAO1 and QS mutant strains (%)

2.2不同濃度氨溴索對細(xì)菌黏附率的影響1.875、3.75ng/m l氨溴索作用4h后，PAO 1菌株的黏附率分別降至空白對照組的23.8%±1.8%、17.1%±3.4%，QS系統(tǒng)缺陷株分別降至空白對照組的52.3%±1.7%、35.3%±5.7%，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，且PAO1株黏附率下降較QS系統(tǒng)缺陷株更為明顯(P＜0.05，表2)。

表2 PAO1以及QS系統(tǒng)缺陷株生物膜中細(xì)菌黏附率(%)Tab.2 Adhesion rate of bacteria on the biofilms of PAO1 and QS mutant strains (%)

3 討 論

近年來隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提高，細(xì)菌生物膜所致的慢性感染也日益受到人們的重視，如生物材料相關(guān)感染以及氣管和尿道插管相關(guān)感染等[8]。銅綠假單胞菌是呼吸道生物膜感染的主要致病菌，由于生物膜極難被抗生素清除，因此，重癥監(jiān)護室氣管插管患者以及介入患者的治療難度明顯加大，甚至危及患者生命。本研究結(jié)果表明，氨溴索對QS系統(tǒng)缺陷株以及PAO 1野生株均有清除作用，但對QS系統(tǒng)缺陷株的清除效果更好。M ittal等[9]報道QS系統(tǒng)能調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌多種毒力因子如外毒素A、彈性蛋白酶、蛋白酶、鼠李糖脂、青膿素的表達(dá)，而這些毒力因子對維持生物膜的結(jié)構(gòu)具有重要作用，提示氨溴索對QS系統(tǒng)缺陷株清除效果更好可能與毒力因子的表達(dá)降低有關(guān)。

細(xì)菌生物膜的形成和發(fā)展是一個動態(tài)過程，一般分為5個階段：最初的定植階段、不可逆黏附階段、結(jié)構(gòu)分化階段、發(fā)展成熟階段和解聚再定植階段[10-11]。細(xì)菌對宿主表面的黏附是形成生物膜的第一步，細(xì)菌黏附可分為可逆性和不可逆性兩個階段。QS系統(tǒng)在不可逆階段開始活化。細(xì)菌的黏附能力被認(rèn)為是評價細(xì)菌生物膜形成能力的重要指標(biāo)[12]。本研究首先探討了氨溴索是否可以降低銅綠假單胞菌的黏附能力，結(jié)果表明氨溴索作用后PAO1野生株以及QS系統(tǒng)缺陷株的黏附率都出現(xiàn)了下降，且PAO1株黏附率下降較QS系統(tǒng)缺陷株更明顯，提示氨溴索干預(yù)了銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)。由于QS系統(tǒng)缺陷株黏附率也出現(xiàn)了下降，提示QS系統(tǒng)并不是調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌黏附的唯一因素，其他的調(diào)節(jié)因素如鞭毛、菌毛、胞外多糖、藻酸鹽等也起到一定作用。

綜上所述，本研究證實氨溴索具有拮抗QS系統(tǒng)ΔlasI ΔrhlI的特性，提示其在降低生物膜形成以及預(yù)防感染方面具有廣泛的用途。同時本研究結(jié)果也為臨床導(dǎo)管相關(guān)性銅綠假單胞菌生物膜感染的治療提供了新的思路。

[1] Potera C. Forging a link between biofilm s and disease[J]. Science, 1999, 283(5409): 1837, 1839.

[2] Li HY, Xia QM, Li FX ,etal. Inhibitory effect of clindamycin on biofilm of mucoidP.aeruginosainvitro[J]. Med J Chin PLA, 2004, 29(10): 875-878. [李鴻雁, 夏前明, 李福祥, 等. 克林霉素對黏液型銅綠假單胞菌生物被膜的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2004, 29(10): 875-878.]

[3] Gup ta R, Schuster M. Quorum sensing m odu lates co lony m o rpho logy th rough alky l quino lones inPseudomonasaeruginosa[J]. BMC Microbiol, 2012, 12: 30.

[4] Jacob S, Sh irw aikar A. Preparation and evaluation of m icroencapsu lated fast m elt tab lets of am b roxo l hydrochloride[J]. Indian J Pharm Sci, 2009, 71(3): 276-284.

[5] Li DX, Li P, Zhou Y. Effects of atom ization inhalation of budesonide and ambroxol on stroke-associated pneumonia[J]. J Logist Univ CAPF (Med Sci), 2012, 21(12): 990-991, 994. [李東旭, 李鵬, 周陽. 布地奈德聯(lián)合氨溴索霧化吸入治療卒中相關(guān)性肺炎療效觀察[J]. 武警后勤學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2012, 21(12): 990-991, 994.]

[6] Girard G, Bloem berg GV. Central role of quorum sensing in regu lating the p roduction of pathogenicity factors inPseudomonasaeruginosa[J]. Future Microbiol, 2008, 3(1): 97-106.

[7] Boulos L, Prévost M, Barbeau B,etal. LIVE/DEAD BacLight: app lication of a new rap id staining m ethod fo r d irect enumeration of viable and total bacteria in drinking water[J]. J Microbiol Methods, 1999, 37(1): 77-86.

[8] Pires D, Sillankorva S, Faustino A,etal. Use of new ly isolated phages for control ofPseudomonasaeruginosaPAO1 and ATCC 10145 biofilms[J]. Res Microbiol, 2011, 162(8): 798-806.

[9] M ittal R, Sharma S, Chhibber S,etal. Contribution of quorumsensing systems to virulence ofPseudomonasaeruginosain an experimental pyelonephritis model[J]. J Microbiol Immunol Infect, 2006, 39(4): 302-309.

[10] Blander JM, Medzhitov R. Regulation of phagosome maturation by signals from toll-like receptors[J]. Science, 2004, 304(5673): 1014-1018.

[11] Singh PK, Schaefer AL, Parsek MR,etal. Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are in fected with bacterial biofilms[J]. Nature, 2000, 407(6805): 762-764.

[12] Lin LH, Yu JL, Lin YY,etal. Effects of allitride on adhesion and exopolysaccharide ofPseudomonasaeruginosabiofilms[J]. Chin J Microecol, 2009, 21(1): 9-12. [林麗華, 余加林, 林雅茵. 大蒜素對銅綠假單胞菌生物膜早期黏附及胞外多糖的影響[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 21(1): 9-12.]

Effects of ambroxol on biofilm adhesion and viability of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing defective strain

LU Qi, ZHONG Hai-ying, LIN Li-hua, LIN Ya-yin, YANG Xi-qiang*, YU Jia-lin*
Department of Neonatology, Children′s Hospital of Chongqing Medical University; Key Laboratory of Developmental Diseases inChildhood Co-organized by the Province and Ministry of Education; Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing, Chongqing InternationalScience and Technology CooperationCenter for Child Development and Disorder, Chongqing 400015, China
*

. YANG Xi-qiang, E-mail: xiqyang@163.com; YU Jia-Lin, E-mail: yujialin486@sohu.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (30772363,30901279), Medical Science Foundationof Chongqing Medical University and Talent Foundation of Chongqing Children′s Hospital

ObjectiveTo investigate the effects of ambroxol on the biofilm viability and pristine adhesion ofPseudomonasaeruginosawild (PAO1) and quorum sensing defective strain (QS, gene deletion of ΔlasI and ΔrhlI).MethodsThe biofilm was treated by different concentrations (0, 1.875, 3.75mg/m l) of ambroxol. The number of colony was measured with agar plate, multifunction fluorometer was used to measure the fluorescence intensity of PAO1 and QS strains at the bottom of 96-well plate. The adhesion ratio (%) was calculated to determine the effects of ambroxol on bacterial biofilm adhesion. ResultsAmbroxol treatment reduced the survival rate of the mutant strains compared to that of wild strain, even though the QS strain had increased the adhesion in the presence of ambroxol compared to that of wild strain (P＜0.05).ConclusionAmbroxol has a property of significantly antagonizing quorum-sensing system, suggesting that it might be of importance in treatment against chronicPseudomonasaeruginosainfections.

ambroxol;Pseudomonasaeruginosa; bacterial adhesion; quorum sensing

R392

A

0577-7402(2013)07-0545-03

2013-03-20；

2013-05-18)

(責(zé)任編輯：張小利)

國家自然科學(xué)基金(30772363，30901279)；重慶醫(yī)科大學(xué)校級項目；2012年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院苗圃人才計劃

蘆起，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，副教授。主要從事新生兒感染和免疫方面的研究

400015 重慶 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科，兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點實驗室，兒科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國際科技合作基地(蘆起、鐘海英、林麗華、林雅茵、楊錫強、余加林)

楊錫強，E-mail：xiqyang@163.com；余加林，E-mail：yujialin486@sohu.com