陳鵬，張波，張莉，張連陽(yáng)

FGFR2功能獲得性突變對(duì)長(zhǎng)骨發(fā)育過(guò)程的影響

陳鵬，張波，張莉，張連陽(yáng)

目的對(duì)比觀察Fgfr2+/S252W突變型小鼠和同窩野生型小鼠長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)發(fā)育情況，探討FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)對(duì)軟骨內(nèi)成骨過(guò)程的影響。方法采用經(jīng)基因敲入技術(shù)建立的模擬人Apert綜合征的Fgfr2+/S252W小鼠模型，經(jīng)繁殖、鑒定后分為Fgfr2+/S252W功能獲得突變型和同窩野生型。于出生后7、10、14、28d分別處死突變型和野生型小鼠各3只，對(duì)長(zhǎng)骨進(jìn)行長(zhǎng)度測(cè)量、X線檢查及M icro CT檢查，另取部分長(zhǎng)骨標(biāo)本進(jìn)行HE染色和免疫組化染色觀察。結(jié)果Fgfr2+/S252W突變小鼠呈典型Apert綜合征圓顱和短顱畸形，體形發(fā)育緩慢，體長(zhǎng)、四肢長(zhǎng)度明顯小于同窩野生小鼠，且長(zhǎng)骨發(fā)育障礙，第二骨化中心延遲出現(xiàn)，骨密度及骨小梁數(shù)量低于同窩野生型小鼠。組織學(xué)觀察可見(jiàn)突變小鼠脛骨近端生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞增殖區(qū)和肥大區(qū)厚度縮短，細(xì)胞排列不及野生型整齊，肥大軟骨細(xì)胞體積小，免疫組化檢測(cè)顯示軟骨相關(guān)增殖、分化基因表達(dá)均減弱。結(jié)論FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)可導(dǎo)致小鼠長(zhǎng)骨發(fā)育障礙。FGFR2可能具有調(diào)控成骨細(xì)胞系及軟骨細(xì)胞系發(fā)育的功能，在骨骼發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。

受體，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，2型；尖頭并指(趾)畸形；軟骨發(fā)生；骨生成

骨生成主要通過(guò)軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨兩種方式，其中長(zhǎng)骨發(fā)育以軟骨內(nèi)成骨為主。Apert綜合征是一種顱縫早閉疾病，由2型成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast grow th factor receptor 2，F(xiàn)GFR2)的功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變引起，患者表現(xiàn)為冠狀縫早閉，四肢短小畸形和并指/趾[1-2]。既往研究顯示FGFR2主要調(diào)控骨發(fā)育的成骨過(guò)程[3-4]，而其對(duì)軟骨內(nèi)成骨的影響研究甚少。有研究顯示，長(zhǎng)骨骺端軟骨組織中存在FGFR2的表達(dá)，且FGFR2功能增強(qiáng)可導(dǎo)致顱底軟骨發(fā)育障礙[5]，結(jié)合Apert綜合征患者四肢發(fā)育畸形的表現(xiàn)，推測(cè)FGFR2可能在軟骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)基因敲入(knock in)技術(shù)建立的模擬人Apert綜合征的Fgfr2+/S252W小鼠模型，對(duì)比觀察同窩野生型和FGFR2獲得性增強(qiáng)突變型小鼠的長(zhǎng)骨發(fā)育情況，以探討FGFR2功能增強(qiáng)能否影響軟骨內(nèi)成骨過(guò)程，從而影響整個(gè)長(zhǎng)骨的發(fā)育。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物來(lái)源 將從美國(guó)NIH引進(jìn)的雄性帶neo基因+突變FGFR2的基因工程小鼠[6]、雄性EII-Cre小鼠分別與雌性C57BL/6J小鼠(2～4月齡)交配，得到的F1代經(jīng)鑒定帶neo基因+突變FGFR2的基因小鼠，將其與F1代EII-Cre小鼠再次交配，EII-Cre啟動(dòng)子去掉FGFR2-neo-S252W的neo基因，在子代中獲得約1/4數(shù)量的Fgfr2+/S252W功能獲得性突變小鼠。對(duì)小鼠進(jìn)行基因型鑒定，按照基因型分為野生型和突變型(Fgfr2+/S252W)兩組，每組中每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)3只。EII-Cre、C57BL/6J小鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有小鼠均為SPF級(jí)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2主要儀器與試劑 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sigm a，Germ any)，PCR儀(GeneAm p，Hong Kong)，電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)，數(shù)字X線攝影機(jī)(LORAD，USA)，M icro CT(Scanco M ed ical，Sw itzer land)，組織切片機(jī)(Leica，Germany)，顯微鏡(O lympus，Japan)，Spot內(nèi)置彩色數(shù)碼相機(jī)(Diagnostic Instruments，USA)。蛋白酶K(Roche，USA)，EDTA粉(上海生物工程有限公司)，膠原Ⅱ(Col Ⅱ)、膠原Ⅹ(Col Ⅹ)、抗體(Santa Cruz，USA)，即用型SABC免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3Fgfr2+/S252W小鼠基因型的鑒定[6]剪取小鼠尾巴，長(zhǎng)約2mm，用含100mg/L蛋白酶K的組織裂解液56℃裂解12h，提取基因組DNA。用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增：①帶neo基因+突變FGFR2小鼠。R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATGTGGGGC-3'；RINA：5'-CCAGACTGCCTTGGGAAAAGC-3'。②EII-Cre小鼠。C1：5'-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3'；C 2：5'-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3'。③Fgfr2+/S252W小鼠。R2I6F1：5'-TAGGTAGTCCA TAACTCGG-3'；R2-7R2：5'-TTGATCCACTGGATG TGGGGC-3'。PCR產(chǎn)物凝膠電泳后，根據(jù)條帶對(duì)小鼠進(jìn)行區(qū)分(圖1)。

圖1 基因鑒定電泳圖Fig. 1 PCR electrophoresis image of gene identification

1.4標(biāo)本取材 對(duì)同窩出生的小鼠根據(jù)鑒定結(jié)果分為野生組和突變組，兩組分別取7、10、14、28d齡小鼠(每組每時(shí)間點(diǎn)3只)，采用頸椎脫臼法處死，留取下肢作為標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5小鼠骨骼X線檢測(cè) 采用美國(guó)LORAD公司的鉬靶X線機(jī)(型號(hào)Selenia)對(duì)同窩野生型和突變型小鼠進(jìn)行X線攝像(參數(shù)為電壓32kV，曝光時(shí)間10ms)，初步觀察兩種基因型小鼠下肢骨形態(tài)及骨皮質(zhì)密度、骨小梁情況等指標(biāo)。

1.6小鼠股骨M icro CT掃描 采用瑞士Scanco Medical小動(dòng)物M icro CT掃描儀對(duì)小鼠股骨進(jìn)行掃描及三維重建。將股骨周圍軟組織清除干凈，70%乙醇固定過(guò)夜后，垂直于水平面放入樣品管中進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)為電壓70kV，電流113μA，中分辨率(20μm)。

1.7組織病理學(xué)觀察 脛骨取材后經(jīng)4%多聚甲醛固定3d，10% EDTA脫鈣3周，常規(guī)石蠟包埋、切片(厚6μm)，HE染色，封固，光鏡下觀察長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板軟骨組織的增殖、分化情況。

1.8免疫組織化學(xué)染色觀察 石蠟切片脫蠟、水化，3%H 2O2室溫孵育10m in，PBS漂洗后山羊血清封閉30m in，加入一抗(Col Ⅱ、Col Ⅹ)4℃過(guò)夜，PBS漂洗后加入適量二抗工作液(37℃、45m in)，再次PBS漂洗后加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(37℃、30m in)，PBS漂洗后，DAB顯色5m in，自來(lái)水沖洗，脫水，封固，光鏡下觀察。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況 肉眼觀察顯示，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠從出生時(shí)整個(gè)體形即小于同窩野生型小鼠，且行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍。出生后1周左右，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠逐漸顯現(xiàn)出異常的頭顱形態(tài)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，頭顱的縱向短縮更加明顯，類似人類Apert綜合征顱骨表型，即圓顱和短顱畸形，中臉縱向發(fā)育不良，而橫徑增加，伴下切牙開(kāi)始向前增長(zhǎng)。Fgfr2+/S252W小鼠體形發(fā)育緩慢，體長(zhǎng)、四肢長(zhǎng)度明顯短于同窩野生小鼠，呈侏儒表型，但未發(fā)現(xiàn)并指/趾畸形[7](圖2)。2.2兩組小鼠長(zhǎng)骨發(fā)育的X線表現(xiàn) 對(duì)同窩野生型和Fgfr2+/S252W突變小鼠進(jìn)行下肢X線攝像檢查發(fā)現(xiàn)，突變小鼠各時(shí)間點(diǎn)的下肢骨長(zhǎng)度明顯短于同窩野生型小鼠(表1)。由圖3可見(jiàn)，在發(fā)育過(guò)程中，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠肢體長(zhǎng)度短于野生型小鼠，且骨皮質(zhì)光密度偏低，干骺端骨小梁稀疏；在干骺端軟骨骨化過(guò)程中，野生型小鼠10d左右出現(xiàn)第二骨化中心，而Fgfr2+/S252W小鼠未出現(xiàn)第二骨化中心，提示其存在軟骨內(nèi)成骨障礙。

圖2 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況Fig. 2 Body and skull development of Fgfr2+/S252W(MT) and w ild type (WT) m ice

表1 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠下肢骨長(zhǎng)度比較(mm，±s，n=3)Tab. 1 Comparison of femur and tibia length between mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice (mm,±s,n=3)

表1 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠下肢骨長(zhǎng)度比較(mm，±s，n=3)Tab. 1 Comparison of femur and tibia length between mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice (mm,±s,n=3)

(1)P＜0.001 compared with WT

Location 7d 10d 14d 28d WT MT WT MT WT MT WT MT Femur 4.70±0.13 3.88±0.16(1)6.52±0.15 5.40±0.17(1)8.59±0.18 7.16±0.17(1)11.19±0.17 9.46±0.17(1)Tibia 6.38±0.10 5.12±0.14(1)8.60±0.15 7.21±0.14(1)11.04±0.18 9.59±0.16(1)15.10±0.24 12.88±0.21(1)

圖3 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠長(zhǎng)骨發(fā)育的X線結(jié)果比較Fig. 3 X-ray examination of long bone development in mutant type (MT) and wile type (WT) mice

2.3兩組小鼠長(zhǎng)骨干骺端發(fā)育的M icro CT觀察 采用M icro CT對(duì)4周齡的小鼠干骺端骨小梁進(jìn)行掃描發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠骨組織含量明顯低于同窩野生型小鼠，且股骨干骺端骨小梁明顯減少、稀疏(圖4)。

2.4兩組小鼠長(zhǎng)骨發(fā)育的組織學(xué)觀察 由圖5可見(jiàn)，HE染色顯示，發(fā)育至第7天，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞基本呈柱狀排列，但不及野生型排列整齊，且肥大軟骨細(xì)胞體積較小，軟骨細(xì)胞增殖區(qū)和肥大區(qū)縮短；發(fā)育至第10天，野生型小鼠脛骨出現(xiàn)第二骨化中心，而Fgfr2+/S252W小鼠長(zhǎng)骨第二骨化中心未出現(xiàn)；發(fā)育至第4周，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠脛骨干骺端骨小梁稀疏，且骨小梁長(zhǎng)度縮短，與X線、M icroCT檢查結(jié)果一致。

2.5兩組小鼠脛骨生長(zhǎng)板Col Ⅱ、Col Ⅹ的表達(dá)免疫組化染色顯示，發(fā)育至第5天，Col Ⅱ主要在生長(zhǎng)板增殖層軟骨表達(dá)，而Col Ⅹ在生長(zhǎng)板肥大層軟骨表達(dá)。與野生型小鼠比較，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠生長(zhǎng)板軟骨Col Ⅱ、Col Ⅹ免疫組化染色顏色淡，增殖層、肥大層陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少(圖6)。

圖4 4周齡Fgfr2+/S252W和野生型小鼠干骺端M icro CT掃描結(jié)果Fig. 4 M icro CT image of femur metaphysis in mutant type (MT) and wile type (WT) mice, 4 weeks after birth

圖5 Fgfr2+/S252W和野生型小鼠脛骨干骺端組織形態(tài)比較(HE ×100)Fig. 5 Comparison of tibia metaphysis in mutant type (MT) and wile type (WT) mice (HE ×100)

圖6 5日齡Fgfr2+/S252W和野生型小鼠脛骨近端生長(zhǎng)板軟骨Col Ⅱ、Col Ⅹ的表達(dá)(免疫組化 ×100)Fig. 6 Col Ⅱ and Col Ⅹ expression in tibia grow th plate of mutant type (MT) and w ile type (WT) m ice 5 days after birth (Immunohistochemistry ×100)

3 討 論

FGFR屬于受體酪氨酸蛋白激酶(recep to r tyrosine kinase，RTK)家族，包括FGFR1、2、3、4共4種受體，它們通過(guò)與FGF結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)FGF信號(hào)與骨骼發(fā)育有密切關(guān)系[1,8]。

既往研究認(rèn)為，在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用的FGFR主要是FGFR3，可在胚胎發(fā)育形成骨化中心前對(duì)增殖和前肥大軟骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，對(duì)軟骨發(fā)育起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[9-11]，而FGFR2主要調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞發(fā)育，可調(diào)控位于軟骨膜、骨膜和顱縫處的前骨生成細(xì)胞和骨生成細(xì)胞的增殖及分化[4]。雖然已有少數(shù)研究在軟骨細(xì)胞系(尤其是成熟的軟骨細(xì)胞中)檢測(cè)到FGFR2的表達(dá)[12-14]，并發(fā)現(xiàn)其在顱底軟骨發(fā)育中具有重要作用[5]，但迄今為止FGFR2在骨骼發(fā)育過(guò)程中對(duì)軟骨內(nèi)成骨的調(diào)控作用研究甚少。

應(yīng)用基因敲入技術(shù)建立的FGFR2功能獲得型基因突變小鼠，其FGFR2功能增強(qiáng)，表現(xiàn)出類似人Apert綜合征的骨骼表型。除了顱縫早閉、圓顱畸形外，還存在體形減小及四肢短縮畸形[6-7,15]，因長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)是軟骨內(nèi)成骨過(guò)程，而該模型小鼠表現(xiàn)為軟骨內(nèi)成骨發(fā)育不良，故考慮FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)可能與軟骨內(nèi)成骨發(fā)育障礙有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)Fgfr2+/S252W小鼠在出生后發(fā)育早期體格較野生型弱小，四肢短縮。出生10d左右，突變型小鼠長(zhǎng)骨第二骨化中心未出現(xiàn)，且骨發(fā)育過(guò)程中骨密度、骨小梁厚度明顯低于同窩野生小鼠。組織學(xué)觀察顯示，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板軟骨增殖區(qū)和成熟肥大區(qū)細(xì)胞排列并未出現(xiàn)類似FGFR3功能增強(qiáng)模型小鼠軟骨細(xì)胞雜亂無(wú)序的排列[16]，但其軟骨細(xì)胞體積縮小，增殖、肥大帶厚度縮短，提示FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)可能抑制軟骨細(xì)胞增殖、分化，導(dǎo)致長(zhǎng)骨軟骨內(nèi)骨化障礙，是突變小鼠長(zhǎng)骨短小、體形減小的組織學(xué)基礎(chǔ)。

FGF信號(hào)可通過(guò)與細(xì)胞表面的FGFR2結(jié)合而對(duì)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。Col Ⅱ主要由增殖軟骨細(xì)胞表達(dá)，而Col Ⅹ主要由肥大軟骨細(xì)胞表達(dá)，可作為軟骨增殖、分化的標(biāo)志基因。本研究結(jié)果顯示，在出生早期，F(xiàn)gfr2+/S252W小鼠Col Ⅱ、Col Ⅹ蛋白表達(dá)水平均較野生型下降，說(shuō)明FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)導(dǎo)致小鼠軟骨增殖、分化功能減弱，使長(zhǎng)骨軟骨內(nèi)骨化過(guò)程受到抑制，這與傳統(tǒng)研究認(rèn)為FGF是一種促細(xì)胞分裂劑，與受體結(jié)合后可增加細(xì)胞的增殖能力[17-18]有所矛盾，需進(jìn)一步論證。

綜上，本研究證實(shí)FGFR2功能持續(xù)增強(qiáng)導(dǎo)致小鼠長(zhǎng)骨發(fā)育障礙，F(xiàn)GFR2可能不僅具有調(diào)控成骨細(xì)胞系發(fā)育的功能，還具有調(diào)控軟骨細(xì)胞系發(fā)育的作用，從而可能影響膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨這兩個(gè)過(guò)程，在骨骼發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。雖然本研究證實(shí)FGFR2信號(hào)在骨骼發(fā)育過(guò)程中對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和分化具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，但由于FGFR2主要調(diào)控成骨細(xì)胞的發(fā)育，長(zhǎng)骨的短縮除了軟骨細(xì)胞發(fā)育障礙的因素外，是否同時(shí)有成骨細(xì)胞發(fā)育異常的參與有待進(jìn)一步研究，且在骨發(fā)育過(guò)程中與軟骨發(fā)育相關(guān)的FGFR1、FGFR3表達(dá)是否存在代償性的變化值得更進(jìn)一步探討。

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Influence of gain-of-function mutation (Ser252Trp) in fibroblast growth factor receptor 2 gene on long bone development

CHEN Peng1,2, ZHANG Bo1, ZHANG Li1, ZHANG Lian-yang*
1Institute of Field Surgery, State Key Laboratory of Trauma, Burn and Combined Injury, Daping Hospital, Third Military MedicalUniversity, Chongqing 400042, China
2Department of Genera Surgery, 324 Hospital of PLA, Chongqing 400020, China
*

, E-mail: hpzhangly@163.com
This work was supported by the National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (2011CB964701)

ObjectiveTo observe the early postnatal long bone development in Fgfr2+/S252Wmutant m ice and littermate wild-type (WT) mice, and explore the effect of continued function enhancement of fibroblast grow th factor receptor 2 (FGFR2) gene on endochondral ossification.MethodsA mouse model of Fgfr2+/S252Wsimulated human Apert syndrome was reproduced by knock-in technique, and then the gain-of-function mutation Fgfr2+/S252Wm ice and littermate WT m ice were obtained after breeding and identification. Three Fgfr2+/S252Wand same number of WT mice were sacrificed at 7, 10, 14 and 28 postnatal days respectively, and the morphology of long bone was examined with X-ray and Micro CT, the structure of bone and cartilage was observed by HE staining, and the expression of gene in grow th plate was observed by immunohistochem ical analysis.ResultsFgfr2+/S252Wmouse model exhibited typical craniosynostosis and brachycephalium of Apert syndrome, accompanied by short stature, grow th retardation of long bone, delayed appearance of secondary ossification center, decrease of bone density and trabecula number. HE staining showed noticeable shortened zones of proliferation and hypertrophic chondrocytes, irregularity of cell arrangement, and small hypertrophic chondrocytes in the grow th plates of the mutant m ice. Immunohistochem ical analysis revealed that the expression of genes related to chondrocytes proliferation and differentiation was decreased in mutant mice.ConclusionsGain-of-function mutation in FGFR2 may lead to abnormal development of long bone in m ice. FGFR2 may have the function of regulating the development both of osteoblast and chondrocyte lineages, and play an important role in the process of skeletal development.

receptor, fibroblast grow th factor, type 2; acrocephalosyndactylia; chondrogenesis; osteogenesis

R682.19

A

0577-7402(2013)07-0540-05

2012-12-22；

2013-05-20)

(責(zé)任編輯：胡全兵)

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2011CB964701)

陳鵬，碩士研究生。主要從事軟骨內(nèi)成骨方面的研究

400042 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，創(chuàng)傷、燒傷及復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[陳鵬(現(xiàn)在解放軍324醫(yī)院普通外科)、張波、張莉、張連陽(yáng)]

張連陽(yáng)，E-mail：hpzhangly@163.com