張媛媛,楊朝暉*,曾光明,汪理科,黃 兢,魏淑梅,馮 婧 (1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410082)

絮凝法廣泛應(yīng)用于水處理領(lǐng)域,絮凝劑的研究開發(fā)對(duì)于水處理具有重要意義.其中,微生物絮凝劑(MBF)具有易降解、無二次污染、高效安全、適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[1-2],越來越受國(guó)內(nèi)外研究者的重視[3-7].對(duì)微生物絮凝劑分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定可以為優(yōu)化絮凝條件、探討絮凝機(jī)理及實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)[8-9],是微生物絮凝劑研究的一個(gè)重要方面.目前,在微生物絮凝劑分子結(jié)構(gòu)的研究中,多數(shù)直接將微生物發(fā)酵液提取物默認(rèn)為微生物絮凝劑的活性成分而作為分子結(jié)構(gòu)研究的對(duì)象,而少有對(duì)發(fā)酵液剩余物質(zhì)絮凝活性進(jìn)行分析的報(bào)道[10-11].為了更準(zhǔn)確地確定微生物絮凝劑分子結(jié)構(gòu)鑒定的對(duì)象及分析其絮凝機(jī)理,作者對(duì)一株產(chǎn)絮凝劑的多粘類芽孢桿菌(菌株編號(hào)GA1)的發(fā)酵液、發(fā)酵液提取粗產(chǎn)品、發(fā)酵液提取剩余物以及粗產(chǎn)品純化后的精產(chǎn)品的絮凝活性進(jìn)行分析,在確定該絮凝劑核心有效成分的基礎(chǔ)上,對(duì)其進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)鑒定及絮凝機(jī)理分析.

MBFGA1是菌株GA1所產(chǎn)的高效微生物絮凝劑,前期研究已證明該絮凝劑對(duì)多種廢水均有較好的絮凝效果[12],具備工業(yè)化生產(chǎn)的潛力[13],有較好的實(shí)際應(yīng)用前景.本研究著力于MBFGA1的性質(zhì)及分子結(jié)構(gòu)鑒定,以期為MBFGA1的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

所用菌種菌株編號(hào)GA1,經(jīng)16S rDNA序列(GenBank序列登陸號(hào)DQ166375)分析鑒定為多粘類芽孢桿菌,命名為 Paenibacillus polymyxa GA1[14].

1.2 絮凝劑提取與純化[15]

將GA1發(fā)酵液4000r/min離心30min,加入2倍體積預(yù)冷丙酮(-24℃),于 4℃冰箱中靜置待析出物穩(wěn)定,離心分離后干燥,得到 MBFGA1粗產(chǎn)品,呈淡黃褐色,與發(fā)酵液顏色相似;將粗產(chǎn)品溶于水,加入Sevage試劑(氯仿與正丁醇按5:1配制)充分振蕩,離心后取上清液,濃縮后進(jìn)行冷凍干燥得 MBFGA1精產(chǎn)品,呈淺黃色;粗提后的發(fā)酵液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮,得到粗提剩余物.

1.3 絮凝劑有效成分鑒定

以對(duì)高嶺土的絮凝率為指標(biāo)檢驗(yàn)發(fā)酵液、粗提剩余物、10g/L粗產(chǎn)品溶液以及10g/L精產(chǎn)品溶液的絮凝活性.測(cè)定方法:取50mL 3g/L的高嶺土溶液,調(diào)節(jié)pH至8,加入2mL 10g/L的CaCl2溶液作為助凝劑,搖勻 3s,加入 0.4mL絮凝劑(對(duì)照試驗(yàn)為等量蒸餾水),迅速搖勻持續(xù) 15s,靜置30min測(cè)定上清液D550.絮凝率計(jì)算公式[16]:

式中:FR為絮凝率;a為樣品實(shí)驗(yàn)中上清液的D550;b為對(duì)照實(shí)驗(yàn)中上清液的D550.

1.4 MBFGA1性質(zhì)成分鑒定[17]

使用紫外可見分光光度計(jì)和傅里葉變換紅外光譜分析儀(varian,USA)對(duì) MBFGA1精產(chǎn)品基本性質(zhì)、特征鍵及分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定;采用苯酚-硫酸法對(duì)糖含量進(jìn)行測(cè)定;采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定;使用zeta電位儀(malvern,British)對(duì)溶液zeta電位進(jìn)行測(cè)定.

1.5 MBFGA1凝膠過濾層析[18]

經(jīng)兩次凝膠層析對(duì)MBFGA1精產(chǎn)品進(jìn)行分離純化.一次層析:層析柱規(guī)格 40cm×2.5cm,層析介質(zhì) Sephadex G-50(Pharmacia,USA),洗脫液0.9%的 NaCl溶液,洗脫速度 0.6mL/min;二次層析:層析柱規(guī)格100cm×1.6cm,層析介質(zhì)Sephadex G-100 (Pharmacia,USA),同樣條件對(duì)一次層析后的樣品進(jìn)行分離.洗脫樣品的收集使用部分收集器,接樣時(shí)間 10min/管,測(cè)定收集樣品的糖含量(以 D485為表征),以管數(shù)為 x軸,D485為 y軸繪制層析出峰圖,收集糖峰透析,干燥后做下一步處理.

1.6 表面形態(tài)分析

使用環(huán)境掃描電鏡(FEI,Netherland)分別對(duì)MBFGA1粗產(chǎn)品、精產(chǎn)品以及層析后產(chǎn)品的表面形態(tài)進(jìn)行分析.

1.7 分子量測(cè)定

采用高效液相色譜法對(duì)MBFGA1精產(chǎn)品各組分進(jìn)行分子量測(cè)定:使用高效液相色譜儀(Agilent,USA)對(duì)樣品進(jìn)行分析,Ultrahydrogel 2000和 500兩根多糖專用凝膠色譜柱串聯(lián)(300mm×7.8mm,排阻限分別為 7×106D 和 4×105D),以0.1mol/L的NaNO3溶液為流動(dòng)相,示差折光檢測(cè)器(RID)檢測(cè).分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為pullulan多糖.

1.8 單糖組成分析

采用氣相色譜法對(duì)MBFGA1精產(chǎn)品各組分進(jìn)行單糖組成分析:先對(duì)多糖樣品進(jìn)行糖基衍生化,之后使用氣相色譜儀(島津,日本)對(duì)衍生化樣品進(jìn)行分析,5%OV-225/AW-DMCS-Chromo-sorb W玻璃填充柱(3mm×2.5m),柱溫210℃,氫焰離子法(FID)檢測(cè).

2 結(jié)果和討論

2.1 絮凝劑活性成分鑒定

從溶液表觀看,發(fā)酵液、粗提剩余物、MBFGA1粗產(chǎn)品溶液及MBFGA1精產(chǎn)品溶液透光率依次增大,掛壁現(xiàn)象逐漸減弱,黏度降低[19],其中精產(chǎn)品溶液為澄清溶液.各溶液對(duì)高嶺土溶液的絮凝率見表1.

表1 各溶液對(duì)高嶺土溶液絮凝率的對(duì)比Table 1 Comparison of kaolin flocculating rate

由表1可知,除粗提剩余物外,另外3種溶液對(duì)高嶺土均有較高的絮凝率,說明發(fā)酵液的丙酮粗提物是MBFGA1的有效成分;在提取物中,精產(chǎn)品溶液為成分更單一的澄清溶液,而與粗產(chǎn)品溶液相比絮凝率降低不大,說明精產(chǎn)品為 MBFGA1的核心有效成分.本研究中以 MBFGA1精產(chǎn)品為微生物絮凝劑的結(jié)構(gòu)鑒定的主要對(duì)象.

對(duì)比發(fā)酵液、粗產(chǎn)品溶液和精產(chǎn)品溶液絮凝率可得,隨著絮凝劑純化的推進(jìn)絮凝效果呈下降趨勢(shì),其中發(fā)酵液絮凝活性最大,精產(chǎn)品溶液絮凝活性最低.推測(cè)原因:發(fā)酵液是微生物代謝過程形成的混合物膠體,不僅含有培養(yǎng)基中殘留的物質(zhì),也有生物代謝中產(chǎn)生的如磷酸鹽[20]等有助于絮凝的物質(zhì);而提取物溶液組成相對(duì)單一,所以絮凝效果低于發(fā)酵液.據(jù)此同時(shí)可得MBFGA1投入實(shí)際應(yīng)用時(shí),直接使用發(fā)酵液即可達(dá)到高絮凝效果、低成本的目的.

2.2 性質(zhì)成分鑒定

MBFGA1精產(chǎn)品的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果為一條平滑曲線,260nm和 280nm附近均沒有吸收峰,說明精產(chǎn)品中不含核酸和蛋白質(zhì).同時(shí),實(shí)驗(yàn)測(cè)定其中糖含量達(dá) 99%以上,可得絮凝劑MBFGA1精產(chǎn)品為多糖類物質(zhì).此外,精產(chǎn)品溶液zeta電位為-25.9,說明絮凝劑表面帶負(fù)電荷,原因可能是分子表面帶有較多的負(fù)電基團(tuán),負(fù)電基團(tuán)之間相互作用使得絮凝劑在水中處于一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài).

2.3 表面形態(tài)及元素組成分析

MBFGA1電鏡掃描照片如圖1所示.由圖1可見,MBFGA1呈現(xiàn)疏松、交聯(lián)的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu).從a到c隨著純化的推進(jìn),樣品表面愈加細(xì)膩,脈絡(luò)更加清晰,孔與孔連接益加緊密,孔隙密度越來越大,鏈與鏈的交聯(lián)愈加明顯,說明 MBFGA1為線性長(zhǎng)鏈分子結(jié)構(gòu),且?guī)в兄ф?長(zhǎng)鏈之間交聯(lián)成網(wǎng)絡(luò),最終形成圖中所示構(gòu)型.同時(shí),干燥的MBFGA1具有極強(qiáng)的韌性,不易研磨為粉末,也證實(shí)了其線性長(zhǎng)鏈分子結(jié)構(gòu).

圖1 不同處理階段下的MBFGA1的掃描電鏡照片(×1000)Fig.1 Scan electron microanalysis of MBFGA1(×1000)

表2 MBFGA1的元素分析 (%)Table 2 Elementary analysis of MBFGA1 (%)

對(duì)MBFGA1粗產(chǎn)品、精產(chǎn)品以及層析后的精產(chǎn)品進(jìn)行能譜掃描以對(duì)其元素組成進(jìn)行分析,分析結(jié)果見表 2.隨著純化的推進(jìn),樣品中 N、S含量明顯降低,可認(rèn)為精產(chǎn)品中所含雜質(zhì),或者部分支鏈上的小分子物質(zhì)與主鏈分離而被去除;此外,層析后精產(chǎn)品中所含元素(除H外)主要有C、O、Na、P、Cl,其中 Na、Cl增加是由于洗脫液殘留,故其中主要含有 C、H、O,也可佐證MBFGA1絮凝劑主鏈成分為多糖.

2.4 凝膠過濾層析

MBFGA1的凝膠過濾層析結(jié)果見圖 2.從一次層析圖可看出:一次層析樣品洗脫液中的糖含量只形成 1個(gè)主峰,即在一次層析的層析條件下絮凝劑顯示為單一組分物質(zhì).根據(jù)凝膠過濾層析原理,收集此峰做下一步處理即可排除層析中雜峰(即雜質(zhì))對(duì)主峰的干擾,使樣品得到純化.

圖2 MBFGA1的凝膠過濾層析Fig.2 Gel chromatography filter graph of MBFGA1

二次層析圖顯示,MBFGA1在二次層析中形成了2個(gè)主峰,說明絮凝劑中包含2種分子量不同的組分;分別收集兩組分,經(jīng)低溫(＜40℃)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、透析以及冷凍真空干燥,得到絮凝劑中的兩組分,分別記為MBFGA1-1和MBFGA1-2.在MBFGA1精產(chǎn)品中二者含量比約為3:1.

2.5 分子量測(cè)定

MBFGA1的高效液相色譜(HPLC)如圖3所示.其中,MBFGA1-1的HPLC圖示差檢測(cè)部分有3個(gè)峰,保留時(shí)間分別為27.136,36.469,46.915min,其中 46.915min為溶劑峰,27.136,36.469min為MBFGA1-1中的兩組分,確定MBFGA1-1為非均一多糖,兩峰面積對(duì)比可知后者僅在 MBFGA1-1中占極小一部分.利用GPC軟件計(jì)算得兩峰對(duì)應(yīng)分子量分別為 1.18×106D 和 5.01×104D.由于5.01×104組分含量極低,可將MBFGA1-1分子量視為 1.18×106D.

MBFGA1-2的HPLC圖示差檢測(cè)部分有2個(gè)峰,保留時(shí)間分別為 26.724,27.576min,其中27.576min為溶劑峰,故MBFGA1-2為均一多糖.計(jì)算得 26.724min所對(duì)應(yīng)組分的分子量為3.08×103D,即 MBFGA1-2 分子量為 3.08×103D.

2.6 單糖組分測(cè)定

MBFGA1的氣相色譜(GC)如圖4所示,由于各批實(shí)驗(yàn)條件不同,單糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間略有差別.單糖標(biāo)準(zhǔn)品GC出峰圖中:0.8min是溶劑氯仿峰,從4.542min開始往后的6個(gè)峰分別為鼠李糖,阿拉伯 糖,木糖,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,其余是雜質(zhì)峰.

圖3 MBFGA1-1和MBFGA1-2的HPLC圖Fig.3 HPLC graphs of MBFGA1-1 and MBFGA1-2

圖4 MBFGA1-1和MBFGA1-2的GC圖Fig.4 GC graphs of MBFGA1-1 and MBFGA1-2

其中,MBFGA1-1的GC圖中共有4個(gè)糖基峰,4.753,7.065,13.653,16.413min依次為鼠李糖,木糖,甘露糖,葡萄糖,其余峰為雜質(zhì)峰,即MBFGA1-1含有4種糖基.根據(jù)各單糖峰面積計(jì)算主要糖基物質(zhì)的量比:其中木糖,甘露糖,葡萄糖三者的物質(zhì)的量比為0.3:1:1.09,而鼠李糖含量太少未算入比例.

MBFGA1-2的 GC圖中共有 5個(gè)糖基峰,5.577,8.028,15.354,16.708,18.428min依次為鼠李糖,木糖,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,五者的物質(zhì)的量比為0.68:0.28:1.82:1:3.73.

2.7 紅外光譜分析

為確保絮凝劑在處理過程中不改變自身的基本結(jié)構(gòu),維持原有性質(zhì),對(duì) MBFGA1及其所包含的兩組分MBFGA1-1和MBFGA1-2均做了紅外光譜分析,如圖5所示.

由圖 5可見,三者主要吸收峰的位置和強(qiáng)度均相近,可得三者分子內(nèi)所含的特征鍵基本一致;此外 MBFGA1中還包含了 MBFGA1-1和MBFGA1-2中的特有峰,如 3911,483,984cm-1.推測(cè)MBFGA1-1和MBFGA1-2在生物體內(nèi)的形成過程一致,或者二者原本就共屬于同一多糖主鏈(即MBFGA1主鏈),由于之間連接的鍵較弱在處理過程中斷開而顯示為2種不同分子量的物質(zhì).

圖5 MBFGA1、MBFGA1-1和MBFGA1-2紅外光譜Fig.5 Fourier transform-infrared spectra of MBFGA1、MBFGA1-1 and MBFGA1-2

3440cm-1附近寬而強(qiáng)的吸收峰為形成氫鍵的多締合—OH強(qiáng)吸收峰,為典型的O—H伸縮振動(dòng);3212,3117cm-1兩個(gè)弱吸收峰(重疊為一寬峰)為殘?zhí)腔稀狢H3和—CH2的C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰;2050cm-1處亦為 C—H吸收峰;1640,1400cm-1分別為—COO—反對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng),可能為開鏈?zhǔn)教腔?1100cm-1處寬峰為吡喃環(huán)中醚鍵—C—O—C—(甲氧基)伸縮振動(dòng)和彎曲振動(dòng)疊加引起;850cm-1是 α-吡喃型糖苷鍵;620cm-1為=C—H吸收峰,即烯烴C—H鍵吸收峰.

MBFGA1及MBFGA1-1和MBFGA1-2分子中都含有 α-吡喃型糖苷鍵,說明分子基本骨架結(jié)構(gòu)一致;羥基、羧基、甲氧基等極性基團(tuán)大量存在,容易和顆粒表面的離子結(jié)合而形成吸附;此外,多締合羥基之間形成氫鍵,使絮凝劑溶解度增大,分子鏈充分伸展,便于架橋形成,而發(fā)生絮凝.結(jié)合絮凝劑的zeta電位值,進(jìn)一步證實(shí)了分子內(nèi)極性基團(tuán)的存在.

3 MBFGA1絮凝機(jī)理探討

與其他多糖類絮凝劑相似,MBFGA1較大的分子量和分子內(nèi)所含的羥基、羧基等極性基團(tuán)是其具有較強(qiáng)絮凝性的主要原因.有研究證明,絮凝劑分子能在顆粒表面產(chǎn)生吸附是絮凝發(fā)生的首要條件[21].MBFGA1分子量達(dá)1.18×106D,具有足夠的范德華力來克服顆粒間的靜電斥力而形成吸附;此外,MBFGA1分子不同鏈節(jié)上的羧基、羥基,可以與顆粒表面帶有的H+、OH-等以氫鍵形式發(fā)生吸附,羧基、甲氧基等極性基團(tuán)易于與顆粒表面的 Ca2+或者其他重金屬離子等以化學(xué)鍵結(jié)合,使溶液的 zeta電位降低,溶液脫穩(wěn),形成吸附;而顆粒與絮體間的靜電力也能使之相互靠近,產(chǎn)生吸附作用[22].

此外,絮凝劑分子在水中的伸展?fàn)顟B(tài)直接影響絮凝劑架橋的發(fā)生,一般認(rèn)為絮凝劑分子鏈充分伸展呈柔性線狀時(shí),有利于絮凝[21].MBFGA1是微生物分泌存在于發(fā)酵液中的天然多糖,糖環(huán)有多個(gè)羥基,溶于水形成氫鍵,保證了其較好的水溶性;同時(shí)糖環(huán)結(jié)構(gòu)及其他基團(tuán)的空間相互作用也使分子鏈不易彎曲.隨著多糖分子量增加,糖環(huán)數(shù)的增多將導(dǎo)致溶解度降低,而分子中存在的羧基等極性基團(tuán)又增加了水溶性,利于分子鏈在水中伸展,增加了分子鏈的有效長(zhǎng)度,為膠體粒子的吸附提供足夠的空間位點(diǎn);未被吸附的鏈節(jié)則成為自由末端或疏松的鏈環(huán)而與其他分子相互架橋,形成絮體.MBFGA1絮凝機(jī)理如圖6所示.

圖6 MBFGA1絮凝機(jī)理示意Fig.6 Proposed flocculating mechanism for MBFGA1

4 結(jié)論

4.1 MBFGA1精產(chǎn)品為該微生物絮凝劑的核心有效成分,為多糖類物質(zhì),由環(huán)狀單糖以α-型糖苷鍵結(jié)合成多糖主鏈,其他小分子物質(zhì)與主鏈結(jié)合形成支鏈,共同構(gòu)建為線性長(zhǎng)鏈分子結(jié)構(gòu);分子內(nèi)含有羥基,羧基,甲氧基等有利于絮凝的基團(tuán).

4.2 MBFGA1精產(chǎn)品中包含 MBFGA1-1和MBFGA1-2兩種分子量不同的組分,三者分子基本結(jié)構(gòu)相似,其中分子量較大的 MBFGA1-1占75%以上,MBFGA1-2僅占25%.

4.3 MBFGA1-1為非均一多糖,分子量分別為1.18×106D 和 5.01×104D(含量極低,忽略不計(jì)),主要糖基組成為木糖,甘露糖和葡萄糖(另含少量鼠李糖),物質(zhì)的量比為 0.3:1:1.09,構(gòu)成MBFGA1-1的基本骨架.

4.4 MBFGA1-2為均一多糖,分子量3.08×103D,糖基組成為鼠李糖,木糖,甘露糖,半乳糖,葡萄糖,五者的物質(zhì)的量比為 0.68:0.28:1.82:1:3.73,構(gòu)成MBFGA1-2的基本骨架.

4.5 MBFGA1絮凝機(jī)理主要為吸附架橋,絮凝劑分子主要靠范德華力、氫鍵和化學(xué)鍵吸附膠體顆粒;分子內(nèi)所含的氫鍵和極性基團(tuán)使MBFGA1分子能夠充分伸展,有效發(fā)揮吸附架橋作用.

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