唐秋英，黃平，金瑛

（深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東深圳518105）

·論著·

干細(xì)胞基因Oct4和Bcl-2在宮頸癌及其癌前病變組織中的表達(dá)及意義

唐秋英，黃平，金瑛

（深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東深圳518105）

目的探討干細(xì)胞基因Oct4及Bcl-2在宮頸癌及其癌前病變中的表達(dá)及意義。方法采用HE、免疫組織化學(xué)、RT-PCR及Western blot檢測Oct4及Bcl-2蛋白在正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸原位癌及浸潤癌(包括高分化、中分化、低分化)中的表達(dá)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果Oct4在正常宮頸組織CIN宮頸癌組織中表達(dá)逐漸增加，其表達(dá)率依次為20%(2/10)、50%(15/30)、90%(18/20)。同樣，Bcl-2在正常宮頸組織中的陽性表達(dá)率為10%(1/10)，在CIN中為40%(12/30)，而在宮頸癌中高達(dá)70%(14/20)。在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌中Bcl-2的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢，且在CINⅢ中Bcl-2表達(dá)高于CINⅠ/Ⅱ。Oct4和Bcl-2蛋白在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌中的表達(dá)兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但與宮頸癌病理類型無關(guān)。結(jié)論Oct4與Bcl-2參與了宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展，Oct4和Bcl-2聯(lián)合檢測有助于為宮頸癌及癌前病變的臨床診治提供一定的理論依據(jù)。

宮頸癌；Oct4基因；Bcl-2基因；腫瘤干細(xì)胞

Oct4是保證哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育有序地進(jìn)行組織分化及個(gè)體發(fā)育的關(guān)鍵基因，其主要表達(dá)于胚胎干細(xì)胞、生殖細(xì)胞及未分化的胚胎癌腫中。近年來研究發(fā)現(xiàn)，上述Oct4基因可表達(dá)于多種成體干細(xì)胞中，與腫瘤的形成有密切關(guān)系。Bcl-2即B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因，是最早于B細(xì)胞白血病及濾泡型淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)的一種抑制細(xì)胞凋亡的基因，Bcl-2蛋白可表達(dá)于正常細(xì)胞的激活及發(fā)育過程中，也可表達(dá)于成熟組織中。本研究通過探討Oct4與Bcl-2基因在宮頸癌及其癌前病變組織中的表達(dá)狀況，為兩種基因作為潛在的癌干細(xì)胞標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇我院2010年1月至2012年6月經(jīng)病理科確診的宮頸病變組織切片，包括正常宮頸組織、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宮頸原位癌及浸潤癌（包括高分化、中分化、低分化）各10例，收集新鮮標(biāo)本并冷凍保存于-70℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCRTrizol法提取組織總RNA，以20 μl DEPC水溶解，RNA定量為110 g/L，在紫外分光光度計(jì)下測得波長為260 nm，280 nm處的吸光度(A)，其A值均在1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μl)如下：DEPC水7.1 μl、5×反應(yīng)緩沖液4.0 μl、dNTPs(10 mmol/L)1.0 μl、Oligo (dT)18(0.5 g/L)1.0 μl、RNA酶抑制劑0.5 μl、總RNA 5.6 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶MuLV 0.8 μl。反應(yīng)條件：70℃，5 min，速置于冰上；42℃，1 h；95℃，10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：cDNA模板2.5 μl、上下游引物(25 mmol/L)各0.5 μl、Taq聚合酶0.15 μl、dNTPs(10 mmol/L)0.5 μl、MgCl2(25 mmol/L)2.5 μl、10×Buffer 2.5 μl、ddH2O16 μl，95℃，45 s；57℃，30 s；72℃，60 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸6 min。1.5%瓊脂糖電泳鑒定產(chǎn)物，數(shù)碼照相并行灰度值分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 HE染色石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化后反藍(lán)30 s，伊紅染色3 min，經(jīng)梯度酒精、二甲苯后中勝樹膠封片。光鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色采用SP法，石蠟切片3 μm，一抗分別用Santa公司濃縮型Oct3/4抗體(l:100稀釋)及鼠抗人Bcl-2單克隆抗體，DAB顯色，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為Bcl-2或Oct4陽性，高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，記錄陽性細(xì)胞百分比，＜10%為陰性，＞10%為陽性。

1.2.4 Western blot檢測宮頸上皮Oct4、Bcl-2的表達(dá)取凍存的宮頸上皮組織，分別加人膜蛋白裂解緩沖液0.5 ml，剪碎勻漿，提取總蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，用樣品緩沖液將各樣品濃度調(diào)至2 μg/μl，-20℃保存。蛋白樣品用前煮沸5 min，12% SDS-PAGE電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，10%脫脂奶粉封閉2 h，分別用小鼠抗Oct3/4、兔抗Bcl-2抗體(1:400稀釋)4℃孵育過夜，洗膜，10 min ×2次，過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、過氧化物酶小鼠抗兔IgG 1:1 000稀釋，室溫孵育2 h，同上洗膜2次，DAB顯色。β-actin為內(nèi)對照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS for windows 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述與分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

Oct4在正常宮頸組織中的陽性表達(dá)率為20% (2/10)，在CIN中為50%(15/30)，而在宮頸癌中高達(dá)90%(18/20）。在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌中的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢，且在CINⅢ中表達(dá)高于CINⅠ/Ⅱ。同樣，Bcl-2蛋白陽性定位主要在胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒，Bcl-2在上述三種組織中逐漸增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 不同臨床病理特征的宮頸組織bcl-2、Oct4的表達(dá)

表2 不同臨床病理特征的宮頸組織bcl-2、Oct4的表達(dá)

注：經(jīng)t檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)，與正常宮頸組織比較，a,bP＜0.05；與CINⅠ/Ⅱ比較，cP＜0.05；與高中分化比較，dP＜0.05。

正常宮頸組織CIN t值/χ2值宮頸癌t值/χ2值CIN分級CINⅠ/ⅡCINⅢt值/χ2值宮頸癌原位癌侵潤癌病理類型鱗癌腺癌病理分化高中分化低分化t值/χ2值10 30 20 0.36±0.03 0.67±0.08a2.11 1.79±0.11ab3.76 20(2/10) 50(15/30)a3.98 90(18/20)ab5.13 0.29±0.03 0.82±0.05a2.87 1.94±0.13ab3.89 10(1/10) 40(12/30)a4.22 70(14/20)ab4.78 20 10 0.58±0.04 1.87±0.12c3.79 30(6/20) 90(9/10)c4.94 0.48±0.04 1.97±0.14c3.88 20(4/20) 80(8/10)c4.85 10 10 1.83±0.11 1.84±0.13 90(9/10) 90(9/10) 1.58±0.10 2.12±0.14 60(6/10) 80(8/10) 16 4 1.52±0.10 1.39±0.09 94(15/16) 75(3/4) 1.45±0.09 1.59±0.11 75(12/16) 50(2/4) 11 9 0.62±0.05 1.85±0.11d3.69 27(3/11) 100(9/9)d5.02 0.81±0.12 1.59±0.14d3.14 36(4/11) 78(7/9)d4.64

3 討論

Oct4是胚胎和生殖細(xì)胞腫瘤中常見的一種干細(xì)胞相關(guān)基因，它作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子在胚胎干細(xì)胞的調(diào)控中起著重要的作用，同時(shí)也在誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（IPS）的體外建立中發(fā)揮積極的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，Oct4在非生殖系統(tǒng)腫瘤中也有表達(dá)[2-3]。本組資料通過對宮頸癌組織Oct4 RNA的檢測，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中Oct4基因表達(dá)較高，正常組織中Oct4基因的表達(dá)較為低，而在宮頸癌組織中Oct4的表達(dá)量與患者組織病理類型等并無較大相關(guān)性。其中正常宮頸組織、CIN和宮頸癌組織Oct4表達(dá)陽性率分別為20%、50%、和90%，陽性率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，可見，Oct4基因在宮頸癌中轉(zhuǎn)錄并且表達(dá)，正常組織中其表達(dá)率及表達(dá)量均低于宮頸癌組織。提示，Oct4基因可能與宮頸癌干細(xì)胞有密切的關(guān)系。

Bcl-2基因是最早在B細(xì)胞白血病和濾泡型淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)一種細(xì)胞凋亡抑制基因，定位于染色體18q21，由于t(14；18)染色體易位以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致Bcl-2蛋白過度表達(dá)[4]。隨后研究報(bào)道，Bcl-2的過度表達(dá)除了與淋巴造血組織腫瘤相關(guān)外，在非淋巴造血組織腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。有研究結(jié)果顯示Bcl-2基因在CINⅢ級中的表達(dá)明顯高于CINⅠ級和Ⅱ級，提示Bcl-2基因的過表達(dá)可能與癌前病變的發(fā)生即鱗狀上皮進(jìn)一步分化失敗有關(guān)，是宮頸癌發(fā)生的早期事件[5]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Bcl-2的表達(dá)在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌組織中表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這就提示Bcl-2的過表達(dá)不僅是宮頸癌發(fā)病的早期事件，其也參與了宮頸癌病變的發(fā)展。

綜上所述，Bcl-2和Oct4在宮頸癌組織中的表達(dá)與宮頸癌病理分化有一定的關(guān)聯(lián)，Oct4與Bcl-2參與了宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展，對Oct4和Bcl-2聯(lián)合檢測，有助于為宮頸癌及癌前病變的臨床診治提供一定的理論依據(jù)。

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Expression of stem cell gene Bcl-2 and Oct4 in cervical carcinoma and precancerous tissues and their clinical significance

TANG Qiu-ying,HUANG Ping,JIN Ying.Department of Gynaecology and Obstetrics,Shenzhen Songgang People's Hospital,Shenzhen 518105,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of stem cell gene Oct4 and Bcl-2 in cervical cancer and precancerous tissues,and to analyze the clinical significance.MethodsHE,immunohistochemistry,RT-PCR and Western blot were used to detect the levels of Oct4 and Bcl-2 protein in normal cervical tissue,and the tissue of cervical intraepithelial neoplasia(CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ),cervical carcinoma in situ and invasive carcinoma(well differentiated,moderately differentiated,poorly differentiated).The results were statistically analyzed.ResultsThe expression of Oct4 gradually increased in normal cervical tissue,CIN,and cervical carcinoma,with the expression rates of 20%(2/10),50%(15/30),90%(18/20),respectively.The expression rate of Bcl-2 was 10%(1/10)in normal cervical tissue,40%(12/30)in CIN,and up to 70%(14/20)in cervical carcinoma,which was higher in CINⅢthan CINⅠand CINⅡ.The expression of Oct4 and Bcl-2 protein showed statistically significant difference between normal cervical tissue,CIN and cervical carcinoma(P＜0.05),but has nothing to do with the pathological type.ConclusionOct4 and Bcl-2 may take part in the occurrence and development of cervical carcinoma.Combined detection of Oct4 and Bcl-2 provides useful information for the early diagnosis and treatment of cervical carcinoma.

Cervical carcinoma;Oct4;Bcl-2 gene;Cancer stem cells

R737.3

A

1003—6350(2013)05—0625—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.05.0270

2012-10-30)

2010年度深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：201003382）

唐秋英。E-mail：tangqiuying@163.com