李強 趙冰 夏輝 歐喜超 傅衍勇 王擷秀 王海英 彭琳 李輝 趙雁林

·論 著 ·

結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白（TB-SA）抗體檢測試劑在結(jié)核病診斷中的應用研究

李強 趙冰 夏輝 歐喜超 傅衍勇 王擷秀 王海英 彭琳 李輝 趙雁林

目的 評價結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白（tuberculosis specific antigen，TB-SA）抗體檢測試劑在結(jié)核病中的應用價值。方法 以天津市和平區(qū)結(jié)核病控制中心、山東省煙臺芝罘區(qū)肺科醫(yī)院和河南省南陽市臥龍區(qū)結(jié)核病防治中心為研究現(xiàn)場，連續(xù)納入2012年4月至10月門診就診的所有肺結(jié)核疑似患者944例，同時納入110名健康志愿者作為對照。對所有納入患者及健康志愿者進行痰涂片、培養(yǎng)、結(jié)核菌素試驗（PPD）和胸部X線檢查，簽署知情同意書后留取血清進行TB-SA抗體檢測。痰涂片采用萋-尼（Ziehl-Neelsen）染色法，培養(yǎng)采用接種酸性羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)?，F(xiàn)場數(shù)據(jù)由雙人錄入，在國家結(jié)核病參比實驗室統(tǒng)一整理分析。結(jié)果 755例確診的活動性結(jié)核病患者，TB-SA抗體檢測法陽性率為74.8%（565/755，95%CI=71.7%～77.9%），遠高于涂片陽性率25.6% （193/755）（χ2=366.59，P＜0.0001）和培養(yǎng)陽性率39.6%（299/755）（χ2=190.12，P＜0.0001）。在培養(yǎng)陽性結(jié)核病患者中，TB-SA抗體檢查敏感度為88.5%（255/288，95%CI=84.8%～92.2%）。在菌陰活動性結(jié)核病患者中，TB-SA抗體檢查敏感度為68.0%（310/456，95%CI=63.7%～72.3%）。TB-SA抗體檢測法在活動性結(jié)核病患者中的陽性預測值為92.3%（565/612，95%CI=90.2%～94.4%），在健康人群中檢測特異度為97.3%（95%CI= 94.3%～100.3%）。結(jié)論 TB-SA抗體檢測法在結(jié)核病患者中陽性檢出率顯著高于涂片和培養(yǎng)，適用于結(jié)核病，特別是菌陰結(jié)核病的診斷；TB-SA抗體檢測法診斷結(jié)核病的特異度高，可用于人群健康體檢。

結(jié)核，肺/診斷； 細菌蛋白質(zhì)類； 抗體，細菌； 試劑盒，診斷

結(jié)核病是影響當前全球公共衛(wèi)生的嚴重問題，我國是全球第二大結(jié)核病高負擔國家。如何及早、準確地診斷痰菌陰性肺結(jié)核患者，以及鑒別潛伏感染者是目前結(jié)核病診斷面臨的重大挑戰(zhàn)之一。

抗體檢測免疫學方法是診斷許多感染性疾病的經(jīng)典方法，具有技術成熟、操作簡單安全、時間短、可以對大規(guī)模樣本進行快速檢測等優(yōu)點，國際和國內(nèi)也不乏使用該方法檢測結(jié)核病的報道。但由于缺乏特異性抗原，抗體檢測法特異度和敏感度低，未被世界衛(wèi)生組織推薦用于結(jié)核病診斷。干擾素釋放試驗通過特異性抗原刺激血液淋巴細胞檢測細胞因子，診斷結(jié)核病的敏感度和特異度高達90%以上［1］，可以診斷潛伏感染結(jié)核病，但價格昂貴，難以實現(xiàn)在基層應用。結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白（tuberculosis specific antigen，TB-SA）僅存在于致病的結(jié)核分枝桿菌中［2］。TB-SA抗體檢測法采用體外表達純化的結(jié)核分枝桿菌TB-SA蛋白抗原，應用酶聯(lián)免疫法檢測血清標本中特異性的TB-SA抗體。該方法操作簡單、安全性好、特異度高，已獲得國際、國內(nèi)多項專利及技術保護。為評價其在我國基層醫(yī)療單位中結(jié)核病診斷及健康篩查中的應用價值，筆者在3個省的3個區(qū)（縣）對該方法進行現(xiàn)場評估研究。

材料和方法

一、材料

TB-SA抗體檢測試劑及PPD試劑由賽普克公司提供。

二、方法

1.研究現(xiàn)場：選擇天津市和平區(qū)結(jié)核病控制中心、山東省煙臺芝罘區(qū)肺科醫(yī)院和河南省南陽市臥龍區(qū)結(jié)核病防治中心為研究現(xiàn)場。

2.樣本量估算：初診疑似肺結(jié)核患者樣本量計

健康志愿者樣本量計算公式： （ ）（Uα）2。n=p 1-pδ假設在健康人中采用結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體檢測的特異度不低于90%（P=0.9），檢驗水準α= 0.05，雙側(cè)U0.05=1.96，容許誤差δ=0.06。樣本含量n=96。

3.研究對象：2012年4月到10月在3個研究現(xiàn)場門診就診的所有初診疑似肺結(jié)核患者，本次研究共納入疑似結(jié)核病患者944例，確診的結(jié)核病患者755例。入選標準：（1）年齡為18～75歲，男女不限，本地常住人口，無免疫系統(tǒng)疾病，近3個月內(nèi)未使用過免疫抑制劑。（2）咳嗽、咯痰＞2周就診的初診結(jié)核病疑似患者。（3）所有入選患者在簽署知情同意書后留取血清進行抗體檢測。健康體檢志愿者入選標準為：無肺部疾患，獲得知情同意，胸部X線檢查陰性的健康者（PPD皮試強陽性者除外），排除結(jié)核分枝桿菌高風險感染者。健康對照納入110名。

4.檢查方法：所有納入的疑似患者及健康志愿者要求進行痰涂片、培養(yǎng)、PPD和胸部X線檢查，并留取血清進行結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體檢測。涂片鏡檢采用Ziehl-Neelsen染色檢查，培養(yǎng)采用簡單法接種酸性羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，陽性菌株運輸?shù)绞〖壗Y(jié)核病參比實驗室采用PNB法進行菌種鑒定試驗。具體操作按照文獻［3］的要求進行。TB-SA抗體檢測按照產(chǎn)品說明書的操作流程進行。

5.數(shù)據(jù)錄入和統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)由專人現(xiàn)場錄入，并由第2個人復核。數(shù)據(jù)錄入結(jié)束后，所有原始數(shù)據(jù)統(tǒng)一上報國家結(jié)核病參比實驗室進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，不同檢測方法之間比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、研究對象基本情況

本次研究共納入疑似結(jié)核病患者944例，確診的結(jié)核病患者為755例，滿足本次研究預設的結(jié)核病患者樣本量要求（n=150）（表1）。健康對照組納入110名，107名TB-SA抗體檢測為陰性，特異度為97.3%（95%CI=94.3%～100.3%）。

二、培養(yǎng)的質(zhì)量控制

總的涂陽培陰率為4.7%（9/193），河南的評估現(xiàn)場涂陽培陰率為9.6%（5/52），總的污染率及各實驗室的污染率均低于5%（表2）。

三、TB-SA抗體檢測法在臨床診斷結(jié)核病患者中的敏感度和特異度

在755例確診結(jié)核病患者中，TB-SA抗體檢測法陽性率為74.8%（565/755，95%CI=71.7%～77.9%），遠高于涂片陽性率25.6%（193/755，95%CI= 22.5%～28.7%）和培養(yǎng)陽性率39.6%（299/755，95%CI=36.1%～43.1%）（χ2=190.12，P＜0.0001）。TB-SA抗體檢測法的陽性預測值為92.3%（95%CI= 90.2%～94.4%），在所有非結(jié)核病患者群（包括健康人和非結(jié)核其他肺部疾病患者）中的特異度為84.2%（95%CI=80.1%～88.3%）（表3）。

表1 各項目點研究對象分類統(tǒng)計

表2 各項目點培養(yǎng)操作的質(zhì)量控制情況

表3 各項目點采用TB-SA抗體檢測法檢測結(jié)核病的敏感度和特異度

四、TB-SA抗體檢測法檢測培養(yǎng)陽性結(jié)核病患者的敏感度

TB-SA抗體檢測法在培養(yǎng)陽性結(jié)核病患者中的陽性檢出率為88.5%（95%CI=84.8%～92.2%），3個研究現(xiàn)場檢測結(jié)果的敏感度差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.533，P=0.766＞0.05），見表4。

五、TB-SA抗體檢測法檢測菌陰結(jié)核病患者的敏感度

TB-SA抗體檢測法對菌陰活動性結(jié)核病患者的敏感度為68.0%（95%CI=63.7%～72.3%），和平區(qū)結(jié)核病控制中心和臥龍區(qū)結(jié)核病防治中心的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.21，P＜0.05），見表5。

討 論

我國結(jié)核病疫情顯示“菌陰”肺結(jié)核患者占大多數(shù)，無癥狀患者比例明顯增加［4］，臨床診斷的難度逐步增大。TB-SA抗體檢測法采用體外表達純化的結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗原，通過酶聯(lián)免疫法檢測血清中特異性抗體用于結(jié)核病診斷。國內(nèi)早期研究結(jié)果顯示，TB-SA抗體檢測法陽性率高于細菌學檢測方法，敏感度高于70%，特異度高于85%［5-6］。

本研究在國內(nèi)3個區(qū)（縣）結(jié)核病診療單位開展，6個月內(nèi)連續(xù)納入944例肺結(jié)核可疑癥狀者，同時進行結(jié)核病細菌學檢查、影像學檢查及TB-SA抗體檢測，共發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者755例。發(fā)現(xiàn)患者比例較高主要是由于山東和河南研究現(xiàn)場納入患者中確診結(jié)核病的患者比例過高引起，與當?shù)鼗颊呓?jīng)過綜合醫(yī)院篩查后轉(zhuǎn)入結(jié)核病診療單位就診有關。755例患者中，TB-SA抗體檢測陽性565例，陽性率為74.8%，明顯高于涂片檢查（25.6%）和培養(yǎng)檢查（39.6%）。在所有非結(jié)核患者中，檢測特異度為84.2%。在培養(yǎng)陽性患者中，TB-SA抗體檢測的敏感度可達88.5%，即使是在菌陰活動性結(jié)核病患者中，TB-SA抗體檢測的陽性率仍接近70%（68.0%）。

表4 各項目點采用TB-SA抗體檢測法檢測培養(yǎng)陽性結(jié)核病患者的敏感度

表5 各項目點采用TB-SA抗體檢測法檢測菌陰結(jié)核病患者的敏感度

陽性預測值可以反映一個檢測方法結(jié)果為陽性的可信度。本研究中，TB-SA抗體檢測總的陽性預測值為92.3%，河南研究現(xiàn)場陽性預測值最高（97.8%），山東研究現(xiàn)場陽性預測值為89.6%，天津研究現(xiàn)場陽性預測值為88.7%；陽性預測值不同的原因是由于不同研究現(xiàn)場門診患者中結(jié)核病患者的比例不同所致。即使是在門診患者中結(jié)核病患者比率為60%的診療機構(gòu)，TB-SA抗體檢測的陽性預測值仍然可以達到85%以上，對不易取得標本的結(jié)核病及菌陰肺結(jié)核的診斷具有較高的價值。

PPD作為人群中篩查疑似結(jié)核病患者的方法，在我國廣泛用于健康體檢，并作為結(jié)核病診斷的輔助指標［7］。由于卡介苗在我國列入兒童計劃免疫程序，人群中PPD陽性率普遍較高，特異度不高，且患者需要在2 d后返回觀察結(jié)果。本研究納入的110名健康人群中，TB-SA抗體檢測陽性僅為3例，特異度高達97.3%，且方法簡單、檢測時間短、可直接出檢測結(jié)果，適用于健康體檢。

本研究中，25.2%的結(jié)核病患者TB-SA檢測陰性，考慮與不同個體免疫水平有關；或患者正處于臨床感染的初期，結(jié)核分枝桿菌抗體的產(chǎn)生處在“窗口期”，可表現(xiàn)為抗體檢測陰性［8］。在189例非結(jié)核病的可疑患者中 （可能患有其他肺部疾?。?，TB-SA陽性44例，可能與我國是結(jié)核病高疫情國家有關，不排除受試者感染結(jié)核分枝桿菌引起血液中相關抗體存在的可能（即潛伏感染者），也可能由于非結(jié)核呼吸系統(tǒng)疾患導致機體免疫應答紊亂。對于這部分患者，筆者將繼續(xù)跟蹤觀察。

［1］Streeton JA，Desem N，Jones SL.Sensitivity and specificity of a gamma intercferon blood test for tuberculosis infection.Int J Tuberc Lung Dis，1998，2（6）：443-450.

［2］Mazen TS，John TB.Secretion of an acid phosphatase（Sap M）by Mycobacterium tuberculosis that is similar to eukaryotic acid phosphatses.Bacteriol，2000，182（23）：6850-6853.

［3］中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京：中國教育文化出版社，2006.

［4］全國第五次結(jié)核病流行學抽樣調(diào)查技術指導組，全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告.中國防癆雜志，2012，34（8）：495-505.

［5］王海英，于春寶，王燕，等.TB-SA抗體檢測對結(jié)核病臨床診斷價值的研究.中國防癆雜志，2008，30（1）：33-36.

［6］高孟秋，初乃惠，王海英，等.結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白抗體檢測在結(jié)核病診斷中的價值.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007，30 （12）：918-920.

［7］中華人民共和國衛(wèi)生部疾病控制司.初治涂陰活動性肺結(jié)核患者免費治療管理指南（試行）.中華結(jié)核病和呼吸雜志，2005，28（10）：667-669.

［8］趙慶蓉，羅濤，朱帆，等.血清結(jié)核分枝桿菌TB-SA抗體在結(jié)核病診斷中的臨床價值.華西藥學雜志，2007，22（5）：591-593.

The application research of tuberculosis specific antigen（TB-SA）antibody detection kit in the diagnosis of tuberculosis

LI Qiang，ZHAO Bing，XIA Hui，OU Xi-chao，F(xiàn)U Yan-yong，WANG Xie-xiu，WANG Hai-ying，PENG Lin，LI Hui，ZHAO Yan-lin. National Reference Tuberculosis Laboratory，National Center for Tuberculosis Control and Prevention，National Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

WANG Xie-xiu，Email：wjsttigo@126.com；ZHAO Yan-lin，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the value of tuberculosis specific antigen（TB-SA）antibody detection kit in the diagnosis of tuberculosis.Methods Nine hundred and forty-four pulmonary tuberculosis suspects were continually recruited from April 2012 to October 2012 in 3 district's TB centers from Tianjin city，Shandong province and Henan province，respectively，110 healthy people were enrolled at the same time.Sputum and serum specimen from all cases were collected for Ziehl-Neelsen staining smear，traditional mycobacterium culture and TB-SA antibody test.PPD skin test and chest X-ray were also examined to all cases.The data were entered separately by 2 people in sites and analyzed by national TB reference laboratory.Results Among 755 active TB patients，the positive rate of TB-SA antibody test were 74.8%（565/755，95%CI：71.7%-77.9%），significantly higher than smear（25.6%，193/755，χ2=366.59，P＜0.0001）and culture（39.6%，299/755，χ2=190.12，P＜0.0001）；its specificity and positive predictive value were 97.3%（95%CI：94.3%-100.3%）and 92.3%（95%CI：90.2%-94.4%），respectively.Among culture-positive TB patients，the sensitivity of TB-SA antibody test was 88.5%（95%CI：84.8%-92.2%）.However，the sensitivity of TB-SA antibody test was 68.0%（95%CI：63.7%-72.3%）among smear-and culture-negative TB patients.Conclusion TB-SA antibody test has significantly higher positive rate than smear and conventional culture，and can be used for the diagnosis of TB patient especially smear-and culturenegative TB patients.In addition，it can be used for healthy screening examination.

Tuberculosis，pulmonary/diagnosis； Bacterial proteins； Antibodies，bacterial； Reagent kits，diagnostic

2013-07-14）

（本文編輯：范永德）

中國防癆協(xié)會結(jié)核病診斷技術評估項目（20120401）

102206北京，中國疾病預防控制中心結(jié)核病預防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室（李強、趙冰、夏輝、歐喜超、趙雁林）；天津市結(jié)核病控制中心（傅衍勇、王擷秀）；山東省結(jié)核病防治所漢光實驗室（王海英）；山東省煙臺市肺科醫(yī)院檢驗科（彭琳）；河南省疾病預防控制中心結(jié)核病控制科（李輝）

王擷秀，Email：wjsttigo@126.com；趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org