鄺小佳 譚守勇 吳碧彤 蔡杏珊 張?jiān)毫?/p>

·論 著 ·

39株對(duì)克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株23S r RNA檢測(cè)結(jié)果分析

鄺小佳 譚守勇 吳碧彤 蔡杏珊 張?jiān)毫?/p>

目的 分析對(duì)克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株23SrRNA的A2058位點(diǎn)的變化。方法 選擇我院菌株庫的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株64株，其中10株為對(duì)全部抗結(jié)核藥物敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；14株為單耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時(shí)耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時(shí)對(duì)克拉霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；10株為廣泛耐藥菌株，同時(shí)對(duì)克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；此外，還有結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv 1株。對(duì)結(jié)核分枝桿菌23S r RNA行PCR檢測(cè)和測(cè)序。結(jié)果 經(jīng)檢測(cè)，H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株沒有A2058突變，只有1株廣泛耐藥臨床分離株檢測(cè)有A2058A-G的突變，其他臨床分離株均沒有突變，在耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中占2.56%（1/39），在廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中占1/10。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)克拉霉素耐藥的機(jī)制中，A2058突變可能不是產(chǎn)生對(duì)克拉霉素耐藥的主要機(jī)制。結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生對(duì)克拉霉素耐藥的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

分枝桿菌，結(jié)核； 克拉霉素； RNA，核糖體，23S； 抗藥性，細(xì)菌

在抗結(jié)核藥物中，克拉霉素屬于第五類抗結(jié)核藥物，WHO建議用于抗結(jié)核治療的大環(huán)內(nèi)酯類藥物僅有克拉霉素［1］。雖然效果不是很確定，但在耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis），廣泛耐藥結(jié)核?。╡xtensively drug-resistant tuberculosis）的治療中，往往需要聯(lián)合使用其組成治療方案。而在耐多藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病的體外藥敏試驗(yàn)中，克拉霉素對(duì)此類細(xì)菌常有效，這也是選擇克拉霉素的原因?？死顾卦诜墙Y(jié)核分枝桿菌中是主要的治療藥物，而其產(chǎn)生耐藥的機(jī)制主要是在23S r RNA中的A2058位點(diǎn)的突變［2］，筆者通過檢測(cè)對(duì)克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的23S rRNA，了解結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)克拉霉素耐藥的機(jī)制是否也有A2058位點(diǎn)的突變。

資料和方法

一、資料

1.菌株：取我院菌株庫的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株64株，其中10株為對(duì)全部抗結(jié)核藥物敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；14株為單耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時(shí)耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時(shí)對(duì)克拉霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；10株為廣泛耐藥菌株，同時(shí)對(duì)克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株。將菌株庫臨床分離株放在36℃溫箱復(fù)蘇，行羅氏培養(yǎng)并進(jìn)行菌型鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)［3］。因目前國(guó)內(nèi)外沒有可參考的克拉霉素耐藥藥物濃度，克拉霉素藥物濃度檢測(cè)采用微量肉湯稀釋法，依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指南（The guidelines of the clinical and laboratory standards institute），把克拉霉素的最低抑菌濃度（MIC）定為15μg/ml［4］。1株為H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株。復(fù)蘇的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株用生理鹽水洗脫菌體，80℃滅菌30 min；離心收集菌體，—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.PCR引物：P1上游引物：5′-CCCAAACCGACACAGGTGGTCA-3′，P1下游引物：3′-AAACTACCCGCCAGGCACTGTC-5′［5］，513 bp。P2上游引物：5′-CCGTAACTTCGGGAGAAGGG-3′，P2下游引物：3′-CCAAACCATCCCGTCGATAT-5′［6］，819 bp。引物均由香港Invitrogen公司提供。

3.標(biāo)準(zhǔn)株：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由香港中文大學(xué)威爾斯親王醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

二、方法

1.體系配制：在65支（包括1株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)管中依次加入40μl滅菌蒸餾水、5μl 10×PCR緩沖液、0.75μl脫氧核糖核苷酸（d NTP）混合液（濃度20 mmol/L）、0.25μl上游引物、0.25μl下游引物、2.5μl氯化鎂（濃度25 mmol/L）和1μl DNA模板，最后加入0.25μl Taq酶并混勻。

2.P1 PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃30 s，退火62℃30 s；延伸70℃45 s；35個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃10 min；PCR產(chǎn)物4℃保存。P2 PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃30 s，退火55℃30 s；延伸70℃45 s；35個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃10 min；PCR產(chǎn)物4℃保存。

3.凝膠電泳：將PCR產(chǎn)物通過2%非變性凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠掃描及儲(chǔ)存。

4.DNA序列分析：將PCR引物作為測(cè)序引物，序列測(cè)定由香港Tech Dragon Limited公司完成，對(duì)序列進(jìn)行BLAST檢索和比對(duì)。

結(jié) 果

1.64 株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的測(cè)序結(jié)果：64株的23S r RNA測(cè)序A2058突變結(jié)果見表1，1株為陽性。另外，1株H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株測(cè)序結(jié)果沒有A2058位點(diǎn)的突變。

2.結(jié)果：經(jīng)過兩組引物的PCR擴(kuò)增、測(cè)序，標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv 1株測(cè)序顯示沒有A2058突變，64株臨床分離株中，在同一株廣泛耐藥菌株經(jīng)過兩組引物的PCR擴(kuò)增，測(cè)序均顯示在同一位點(diǎn)A2058，有原來的腺嘌呤A改變?yōu)轼B嘌呤G的突變，其他臨床分離株均沒有突變。在耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中僅占2.56%（1/39），在廣泛耐藥菌株中占1/10。

討 論

在治療結(jié)核病的藥物中，可以選用的有效藥物不多，只有15種［1］，特別是耐藥結(jié)核病，而耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病可選擇的藥物更少。在小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，克拉霉素對(duì)多種分枝桿菌在MIC為4～16 mg/L時(shí)，作用顯著強(qiáng)于紅霉素，稍弱于氟喹諾酮類藥物，可適當(dāng)提高利福平對(duì) H37Rv菌株的活性，但不能提高利福平和異煙肼對(duì)其他分枝桿菌的作用，在巨噬細(xì)胞內(nèi)克拉霉素對(duì)結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)高度活性，與利福平合用對(duì)耐利福平和異煙肼的菌株有協(xié)同作用［7］。在我院的體外藥敏試驗(yàn)中，顯示克拉霉素往往對(duì)耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株有效，當(dāng)然也有部分顯示耐藥的。

目前，在其他細(xì)菌中，如大腸埃希菌、龜膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等產(chǎn)生對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的機(jī)理中，重點(diǎn)集中在23S rRNA中出現(xiàn)A2058位點(diǎn)的突變，主要是在A2058位點(diǎn)的腺嘌呤A改變?yōu)轼B嘌呤G的突變，對(duì)結(jié)核分枝桿菌23S rRNA中A2058位點(diǎn)突變檢測(cè)未見報(bào)道［8-12］。本研究通過對(duì)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在對(duì)克拉霉素敏感的臨床分離株中都沒有在23S rRNA中出現(xiàn)A2058位點(diǎn)的突變；而在對(duì)克拉霉素耐藥的臨床分離株中，僅1株廣泛耐藥臨床分離株在23S r RNA中出現(xiàn)A2058位點(diǎn)的突變（占2.56%），在廣泛耐藥臨床分離株中占1/10。在其他細(xì)菌中，A2058位點(diǎn)的突變?yōu)榭死顾禺a(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制，但本研究結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)克拉霉素耐藥的機(jī)制中，A2058突變可能不是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生對(duì)克拉霉素耐藥的主要機(jī)制。結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生對(duì)克拉霉素耐藥的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

表1 64株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株23S rRNA A2058突變測(cè)序結(jié)果（株）

［1］Falzon D，Jaramillo E，Schünemann HJ，et al.WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis：2011 update.Eur Respir J，2011，38（3）：516-528.

［2］Vester B，Douthwaite S.Macrolide resistance conferred by base substitutions in 23S rRNA.Antimicrob Agents Chemother，2001，45（1）：1-12.

［3］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程.北京：中國(guó)教育文化出版社，2006：8-68.

［4］National Committee for Clinical Laboratory Standards.Susceptibility testing mycobacteria，nocardia，and other aerobic actinomycetes：approved standard.Wayne（USA）：National Committee for Clinical Laboratory Standards，2003.

［5］Richter E，Rüsch-Gerdes S，Hillemann D.First linezolid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob Agents Chemother，2007，51（4）：1534-1536.

［6］Jamal MA，Maeda S，Nakata N，et al.Molecular basis of clarithromycin-resistance in Mycobacterium avium intracellulare complex.Tuber Lung Dis，2000，80（1）：1-4.

［7］程書權(quán)，孔淑敏.大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在某些細(xì)菌感染治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀.世界臨床藥物，2005，26（11）：670-674.

［8］Siqmund CD，Ettayebi M，Morqan EA，et al.Antibiotic resistance mutations in 16S and 23S ribosomal RNA genes of Escherichia coli.Nucleic Acids Res，1984，12（11）：4653-4663.

［9］Wallace RJ Jr，Meier A，Brown BA，et al.Genetic basis for clarithromycin resistance among isolates of Mycobacterium chelonae and Mycobacterium abscessus.Antimicrob Agents Chemother，1996，40（7）：1676-1681.

［10］Griffith DE，Brown-Elliott BA，Langsjoen B，et al.Clinical and molecular analysis of macrolide resistance in Mycobacterium avium complex lung disease.Am J Respir Crit Care Med，2006，174（8）：928-934.

［11］Meier A，Kirschner P，Springer B，et al.Identification of mutations in 23S rRNA gene of clarithromycin-resistant Mycobacterium intracellulare.Antimicrob Agents Chemother，1994，38 （2）：381-384.

［12］Burman WJ，Stone BL，Brown BA，et al.AIDS-related Mycobacterium lansasii infection with initial resistance to clarithromycin.Diagn Microbiol Infect Dis，1998，31（2）：369-371.

（本文編輯：郭萌）

·通 知 ·

我國(guó)第一部《中國(guó)防癆史》已由人民衛(wèi)生出版社出版

2009年4月，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局委托中國(guó)防癆協(xié)會(huì)負(fù)責(zé)組織編寫《中國(guó)防癆史》。經(jīng)過3年多的努力，我國(guó)第一部《中國(guó)防癆史》的編撰工作全部完成，于2013年3月由人民衛(wèi)生出版社出版。

《中國(guó)防癆史》由原衛(wèi)生部副部長(zhǎng)、中國(guó)工程院院士王隴德?lián)沃鲗彛l(wèi)生部疾病預(yù)防控制司司長(zhǎng)、中國(guó)防癆協(xié)會(huì)名譽(yù)理事長(zhǎng)戴志澄教授，以及疾病預(yù)防控制局肖東樓專員、中國(guó)防癆協(xié)會(huì)副理事長(zhǎng)兼秘書長(zhǎng)萬利亞擔(dān)任主編。全國(guó)政協(xié)副主席、中國(guó)科協(xié)主席、中國(guó)科學(xué)院院士韓啟德為該書題詞“以史為鑒，以人為鏡”，原衛(wèi)生部部長(zhǎng)張文康題詞“總結(jié)歷史經(jīng)驗(yàn)，啟迪當(dāng)代防癆”，原副部長(zhǎng)殷大奎題詞“弘揚(yáng)先輩防癆精神，防治結(jié)核造福人類”。

全國(guó)人大常委會(huì)副委員長(zhǎng)、原衛(wèi)生部部長(zhǎng)、中國(guó)科學(xué)院院士陳竺為本書題寫序言。他在“序言”中指出，縱觀歷史，我國(guó)人民與結(jié)核病搏斗了數(shù)千年，一代又一代防癆人不懈地努力奮斗，結(jié)核病防治工作取得了顯著進(jìn)展，結(jié)合我國(guó)實(shí)際，創(chuàng)建了具有中國(guó)特色的結(jié)核病防治體系，為全球控制結(jié)核病做出了巨大的貢獻(xiàn)。《中國(guó)防癆史》是一部具有很高參考價(jià)值的醫(yī)學(xué)史書，是我國(guó)醫(yī)學(xué)發(fā)展史的重要組成部分。本書的出版，體現(xiàn)了中國(guó)防癆界團(tuán)結(jié)協(xié)作和敢于開拓創(chuàng)新的精神，厚載著中國(guó)防癆界沉甸甸的歷史文化底蘊(yùn)。本書作為歷史與當(dāng)代的結(jié)合，結(jié)核病管理與相關(guān)技術(shù)的合成，適合全國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)工作者、臨床醫(yī)師、醫(yī)學(xué)史研究者、衛(wèi)生管理人員及廣大醫(yī)學(xué)生閱讀和參考，也可作為廣大結(jié)核病防治工作者上崗培訓(xùn)的參考教材。

盛世修史是中華民族的優(yōu)良傳統(tǒng)。中國(guó)防癆協(xié)會(huì)精心組織老、中、青年專家和學(xué)者，本著尊重史實(shí)、承上啟下、繼往開來、服務(wù)當(dāng)代和有益后世的原則，通過收集、回憶、記述并查閱大量的歷史文獻(xiàn)，經(jīng)過反復(fù)核實(shí)和修改，歷時(shí)3年多的艱辛，終于完成了我國(guó)首部《中國(guó)防癆史》。全書共13章95萬字，140余幅珍貴的歷史照片，資料翔實(shí)，圖文并茂，真實(shí)、系統(tǒng)地記述和反映了各個(gè)歷史時(shí)期人們對(duì)結(jié)核病的認(rèn)識(shí)、預(yù)防、治療方法、防治策略和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn)，展現(xiàn)了不同時(shí)代無數(shù)防癆工作者及社會(huì)各界人士與結(jié)核病斗爭(zhēng)的光輝歷程。同時(shí)，還收集了全國(guó)各省、自治區(qū)、直轄市防癆簡(jiǎn)史，以及中國(guó)防癆界泰斗級(jí)人物的光輝事跡。廣大讀者，特別是從事結(jié)核病防治和預(yù)防保健的工作者，可從書中感受防癆前輩的教誨，體味中國(guó)防癆事業(yè)的輝煌與坎坷。

本書單價(jià)120元（含郵費(fèi)），款到發(fā)貨，郵局匯款或銀行轉(zhuǎn)賬均可。

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（中國(guó)防癆協(xié)會(huì)秘書處）

Analyses of 23S r RNAs of 39 clarithomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates

KUANG Xiao-jia，TAN Shou-yong，WU Bi-tong，CAI Xing-shan，ZHANG Yuan-liang. Four Department of Internal Medicine，the Chest Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510095，China

KUANG Xiao-jia，Email：judy83573615@126.com

Objective To investigate the changes of 23S rRNA at site 2058 of clarithromycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates.Methods One Mycobacterium tuberculosis H37Rv standard strain and 64 isolates were detected，in which 39 clarithromycin-resistant isolates，25 clarithromycin-sensitive isolates.The 23S rRNAs of Mycobacterium tuberculosis isolates were analyzed by polymerase chain reaction（PCR）and sequencing. Results The 23S rRNA of Mycobacterium tuberculosis H37Rv standard strain did not found the mutation at site 2058.Of 64 Mycobacterium tuberculosis isolates，only 1 extensively drug-resistant（XDR）strain had A2058A-G mutation of 23S r RNA，which account 2.56%（1/39）clarithromycin-resistant strains and 1/10 XDR strains.Conclusion The mutation of 23S rRNA at site 2058 of Mycobacterium tuberculosis may not be the main cause inducing its clarithromycin resistance.The mechanism of Mycobacterium tuberculosis clarithromycin resistance need be further studied.

Mycobacterium tuberculosis； Clarithromycin； RNA，ribosomal，23S； Drug resistance，bacterial

2013-05-23）

510095廣州市胸科醫(yī)院內(nèi)四科

鄺小佳，Email：judy83573615@126.com