鄺小佳 譚守勇 吳碧彤 蔡杏珊 張院良

·論 著 ·

39株對克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株23S r RNA檢測結(jié)果分析

鄺小佳 譚守勇 吳碧彤 蔡杏珊 張院良

目的 分析對克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株23SrRNA的A2058位點的變化。方法 選擇我院菌株庫的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株64株，其中10株為對全部抗結(jié)核藥物敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；14株為單耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時對克拉霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；10株為廣泛耐藥菌株，同時對克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；此外，還有結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv 1株。對結(jié)核分枝桿菌23S r RNA行PCR檢測和測序。結(jié)果 經(jīng)檢測，H37Rv標準株沒有A2058突變，只有1株廣泛耐藥臨床分離株檢測有A2058A-G的突變，其他臨床分離株均沒有突變，在耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中占2.56%（1/39），在廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中占1/10。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素耐藥的機制中，A2058突變可能不是產(chǎn)生對克拉霉素耐藥的主要機制。結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生對克拉霉素耐藥的機制有待進一步研究。

分枝桿菌，結(jié)核； 克拉霉素； RNA，核糖體，23S； 抗藥性，細菌

在抗結(jié)核藥物中，克拉霉素屬于第五類抗結(jié)核藥物，WHO建議用于抗結(jié)核治療的大環(huán)內(nèi)酯類藥物僅有克拉霉素［1］。雖然效果不是很確定，但在耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis），廣泛耐藥結(jié)核病（extensively drug-resistant tuberculosis）的治療中，往往需要聯(lián)合使用其組成治療方案。而在耐多藥結(jié)核病、廣泛耐藥結(jié)核病的體外藥敏試驗中，克拉霉素對此類細菌常有效，這也是選擇克拉霉素的原因?？死顾卦诜墙Y(jié)核分枝桿菌中是主要的治療藥物，而其產(chǎn)生耐藥的機制主要是在23S r RNA中的A2058位點的突變［2］，筆者通過檢測對克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的23S rRNA，了解結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素耐藥的機制是否也有A2058位點的突變。

資料和方法

一、資料

1.菌株：取我院菌株庫的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株64株，其中10株為對全部抗結(jié)核藥物敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；14株為單耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；15株為耐多藥，同時對克拉霉素敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株；10株為廣泛耐藥菌株，同時對克拉霉素耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株。將菌株庫臨床分離株放在36℃溫箱復(fù)蘇，行羅氏培養(yǎng)并進行菌型鑒定及藥物敏感性試驗［3］。因目前國內(nèi)外沒有可參考的克拉霉素耐藥藥物濃度，克拉霉素藥物濃度檢測采用微量肉湯稀釋法，依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會指南（The guidelines of the clinical and laboratory standards institute），把克拉霉素的最低抑菌濃度（MIC）定為15μg/ml［4］。1株為H37Rv標準株。復(fù)蘇的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株用生理鹽水洗脫菌體，80℃滅菌30 min；離心收集菌體，—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.PCR引物：P1上游引物：5′-CCCAAACCGACACAGGTGGTCA-3′，P1下游引物：3′-AAACTACCCGCCAGGCACTGTC-5′［5］，513 bp。P2上游引物：5′-CCGTAACTTCGGGAGAAGGG-3′，P2下游引物：3′-CCAAACCATCCCGTCGATAT-5′［6］，819 bp。引物均由香港Invitrogen公司提供。

3.標準株：結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv由香港中文大學威爾斯親王醫(yī)院微生物實驗室提供。

二、方法

1.體系配制：在65支（包括1株H37Rv標準株）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)管中依次加入40μl滅菌蒸餾水、5μl 10×PCR緩沖液、0.75μl脫氧核糖核苷酸（d NTP）混合液（濃度20 mmol/L）、0.25μl上游引物、0.25μl下游引物、2.5μl氯化鎂（濃度25 mmol/L）和1μl DNA模板，最后加入0.25μl Taq酶并混勻。

2.P1 PCR擴增程序：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃30 s，退火62℃30 s；延伸70℃45 s；35個循環(huán)；最后延伸72℃10 min；PCR產(chǎn)物4℃保存。P2 PCR擴增程序：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃30 s，退火55℃30 s；延伸70℃45 s；35個循環(huán)；最后延伸72℃10 min；PCR產(chǎn)物4℃保存。

3.凝膠電泳：將PCR產(chǎn)物通過2%非變性凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠掃描及儲存。

4.DNA序列分析：將PCR引物作為測序引物，序列測定由香港Tech Dragon Limited公司完成，對序列進行BLAST檢索和比對。

結(jié) 果

1.64 株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的測序結(jié)果：64株的23S r RNA測序A2058突變結(jié)果見表1，1株為陽性。另外，1株H37Rv標準株測序結(jié)果沒有A2058位點的突變。

2.結(jié)果：經(jīng)過兩組引物的PCR擴增、測序，標準株H37Rv 1株測序顯示沒有A2058突變，64株臨床分離株中，在同一株廣泛耐藥菌株經(jīng)過兩組引物的PCR擴增，測序均顯示在同一位點A2058，有原來的腺嘌呤A改變?yōu)轼B嘌呤G的突變，其他臨床分離株均沒有突變。在耐克拉霉素的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中僅占2.56%（1/39），在廣泛耐藥菌株中占1/10。

討 論

在治療結(jié)核病的藥物中，可以選用的有效藥物不多，只有15種［1］，特別是耐藥結(jié)核病，而耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病可選擇的藥物更少。在小鼠試驗中發(fā)現(xiàn)，克拉霉素對多種分枝桿菌在MIC為4～16 mg/L時，作用顯著強于紅霉素，稍弱于氟喹諾酮類藥物，可適當提高利福平對 H37Rv菌株的活性，但不能提高利福平和異煙肼對其他分枝桿菌的作用，在巨噬細胞內(nèi)克拉霉素對結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)高度活性，與利福平合用對耐利福平和異煙肼的菌株有協(xié)同作用［7］。在我院的體外藥敏試驗中，顯示克拉霉素往往對耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株有效，當然也有部分顯示耐藥的。

目前，在其他細菌中，如大腸埃希菌、龜膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、鳥-胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等產(chǎn)生對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的機理中，重點集中在23S rRNA中出現(xiàn)A2058位點的突變，主要是在A2058位點的腺嘌呤A改變?yōu)轼B嘌呤G的突變，對結(jié)核分枝桿菌23S rRNA中A2058位點突變檢測未見報道［8-12］。本研究通過對結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的檢測，發(fā)現(xiàn)在對克拉霉素敏感的臨床分離株中都沒有在23S rRNA中出現(xiàn)A2058位點的突變；而在對克拉霉素耐藥的臨床分離株中，僅1株廣泛耐藥臨床分離株在23S r RNA中出現(xiàn)A2058位點的突變（占2.56%），在廣泛耐藥臨床分離株中占1/10。在其他細菌中，A2058位點的突變?yōu)榭死顾禺a(chǎn)生耐藥的重要機制，但本研究結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對克拉霉素耐藥的機制中，A2058突變可能不是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生對克拉霉素耐藥的主要機制。結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生對克拉霉素耐藥的機制有待進一步研究。

表1 64株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株23S rRNA A2058突變測序結(jié)果（株）

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（本文編輯：郭萌）

·通 知 ·

我國第一部《中國防癆史》已由人民衛(wèi)生出版社出版

2009年4月，中華人民共和國衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制局委托中國防癆協(xié)會負責組織編寫《中國防癆史》。經(jīng)過3年多的努力，我國第一部《中國防癆史》的編撰工作全部完成，于2013年3月由人民衛(wèi)生出版社出版。

《中國防癆史》由原衛(wèi)生部副部長、中國工程院院士王隴德?lián)沃鲗?，原衛(wèi)生部疾病預(yù)防控制司司長、中國防癆協(xié)會名譽理事長戴志澄教授，以及疾病預(yù)防控制局肖東樓專員、中國防癆協(xié)會副理事長兼秘書長萬利亞擔任主編。全國政協(xié)副主席、中國科協(xié)主席、中國科學院院士韓啟德為該書題詞“以史為鑒，以人為鏡”，原衛(wèi)生部部長張文康題詞“總結(jié)歷史經(jīng)驗，啟迪當代防癆”，原副部長殷大奎題詞“弘揚先輩防癆精神，防治結(jié)核造福人類”。

全國人大常委會副委員長、原衛(wèi)生部部長、中國科學院院士陳竺為本書題寫序言。他在“序言”中指出，縱觀歷史，我國人民與結(jié)核病搏斗了數(shù)千年，一代又一代防癆人不懈地努力奮斗，結(jié)核病防治工作取得了顯著進展，結(jié)合我國實際，創(chuàng)建了具有中國特色的結(jié)核病防治體系，為全球控制結(jié)核病做出了巨大的貢獻。《中國防癆史》是一部具有很高參考價值的醫(yī)學史書，是我國醫(yī)學發(fā)展史的重要組成部分。本書的出版，體現(xiàn)了中國防癆界團結(jié)協(xié)作和敢于開拓創(chuàng)新的精神，厚載著中國防癆界沉甸甸的歷史文化底蘊。本書作為歷史與當代的結(jié)合，結(jié)核病管理與相關(guān)技術(shù)的合成，適合全國預(yù)防醫(yī)學工作者、臨床醫(yī)師、醫(yī)學史研究者、衛(wèi)生管理人員及廣大醫(yī)學生閱讀和參考，也可作為廣大結(jié)核病防治工作者上崗培訓的參考教材。

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（中國防癆協(xié)會秘書處）

Analyses of 23S r RNAs of 39 clarithomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates

KUANG Xiao-jia，TAN Shou-yong，WU Bi-tong，CAI Xing-shan，ZHANG Yuan-liang. Four Department of Internal Medicine，the Chest Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510095，China

KUANG Xiao-jia，Email：judy83573615@126.com

Objective To investigate the changes of 23S rRNA at site 2058 of clarithromycin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates.Methods One Mycobacterium tuberculosis H37Rv standard strain and 64 isolates were detected，in which 39 clarithromycin-resistant isolates，25 clarithromycin-sensitive isolates.The 23S rRNAs of Mycobacterium tuberculosis isolates were analyzed by polymerase chain reaction（PCR）and sequencing. Results The 23S rRNA of Mycobacterium tuberculosis H37Rv standard strain did not found the mutation at site 2058.Of 64 Mycobacterium tuberculosis isolates，only 1 extensively drug-resistant（XDR）strain had A2058A-G mutation of 23S r RNA，which account 2.56%（1/39）clarithromycin-resistant strains and 1/10 XDR strains.Conclusion The mutation of 23S rRNA at site 2058 of Mycobacterium tuberculosis may not be the main cause inducing its clarithromycin resistance.The mechanism of Mycobacterium tuberculosis clarithromycin resistance need be further studied.

Mycobacterium tuberculosis； Clarithromycin； RNA，ribosomal，23S； Drug resistance，bacterial

2013-05-23）

510095廣州市胸科醫(yī)院內(nèi)四科

鄺小佳，Email：judy83573615@126.com