袁小亮 張?zhí)焱?朱家馨 鄭文爭(zhēng) 雷建平 涂少華 羅一鈞 劉惟優(yōu)

·論 著 ·

江西省結(jié)核分枝桿菌耐二線抗結(jié)核藥的分子學(xué)特征

袁小亮 張?zhí)焱?朱家馨 鄭文爭(zhēng) 雷建平 涂少華 羅一鈞 劉惟優(yōu)

目的 初步明確江西省耐二線抗結(jié)核藥相關(guān)基因突變的特征，評(píng)價(jià)等位基因特異性多重PCR（multiplex allele-specific polymerase chain reaction，MAS-PCR）檢測(cè)二線抗結(jié)核藥耐藥性的可行性。方法 采用DNA測(cè)序方法和MAS-PCR技術(shù)，對(duì)江西省52株耐二線抗結(jié)核藥的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)檢測(cè)。結(jié)果 DNA測(cè)序分析：39株耐氧氟沙星（Ofx）菌株中，32株存在gyrA基因錯(cuò)義突變，2株發(fā)生gyrB基因錯(cuò)義突變。29株耐卡那霉素（Km）或卷曲霉素（Cm）菌株中，22株為rrs1401位點(diǎn)A→G突變。52株耐二線抗結(jié)核藥的結(jié)核分枝桿菌，40株為北京基因型（76.92%，40/52），其中17株北京基因型菌株發(fā)生gyrA-GAC94GGC突變（42.50%，17/40），19株北京基因型菌株發(fā)生rrs-A1401G突變（47.50%，19/40）。北京基因型與基因突變類型gyrA-GAC94GGC和rrs-A1401G無(wú)明顯相關(guān)性（χ2=1.16、1.92，P值均＞0.05）。MAS-PCR檢測(cè)Ofx耐藥株的敏感度為61.54%（24/39），檢測(cè)Km或Cm耐藥株的敏感度為79.31%（23/29）。結(jié)論gyrA基因94位密碼子突變是江西省結(jié)核分枝桿菌Ofx耐藥的主要機(jī)制；rrs-A1401G突變則是Km或Cm耐藥的主要原因。MAS-PCR方法對(duì)于快速檢測(cè)二線抗結(jié)核藥的耐藥性有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

分枝桿菌，結(jié)核； 抗藥性，細(xì)菌； 抗生素類，抗結(jié)核； 卡那霉素； 卷曲霉素硫酸鹽； 聚合酶鏈反應(yīng)； 江西

耐多藥（multidrug-resistant，MDR）和廣泛耐藥（extensively drug-resistant，XDR）結(jié)核病的出現(xiàn)對(duì)全球結(jié)核病防控提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。2007—2008年全國(guó)結(jié)核病耐藥基線調(diào)查顯示：肺結(jié)核耐多藥率為8.32%，廣泛耐藥率為0.68%［1］。二線抗結(jié)核藥是治療耐多藥結(jié)核病的主要藥物。研究提示：氟喹諾酮類藥物能明顯改善耐多藥結(jié)核病患者的預(yù)后；相反，對(duì)氟喹諾酮類耐藥意味著較低治愈率和更高的死亡率［2-3］。因此，快速明確二線抗結(jié)核藥的耐藥性，對(duì)于制定合理化療方案和評(píng)估耐多藥結(jié)核病患者的預(yù)后至關(guān)重要。不同地區(qū)耐藥相關(guān)基因突變類型和頻率不盡相同［4-5］，明確局部區(qū)域 Mtb耐二線抗結(jié)核藥的基因突變位點(diǎn)類型及頻率分布特征，將為臨床快速診斷耐二線抗結(jié)核藥的結(jié)核病提供重要的分子生物學(xué)信息。

近年來(lái)，等位基因特異性多重聚合酶鏈反應(yīng)（multiplex allele-specific PCR，MAS-PCR）已成功用于一線抗結(jié)核藥耐藥性的分析［6］，但其在二線抗結(jié)核藥耐藥性檢測(cè)的應(yīng)用研究較少。此外，MASPCR對(duì)不同區(qū)域的結(jié)核分枝桿菌抗結(jié)核藥耐藥性的檢測(cè)效能（敏感度）差異可能很大。所以，筆者對(duì)來(lái)自江西省耐二線抗結(jié)核藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行了MAS-PCR和耐藥相關(guān)基因DNA測(cè)序分析，初步明確該地區(qū)二線抗結(jié)核藥耐藥相關(guān)基因突變特征，探討MAS-PCR在二線抗結(jié)核藥耐藥性檢測(cè)的可行性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料和方法

一、菌株來(lái)源和藥敏實(shí)驗(yàn)

1.菌株來(lái)源：2010年7月至2011年6月期間篩選的52株耐二線抗結(jié)核藥的MDR結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，來(lái)自江西省胸科醫(yī)院（MDR37株）和贛州市第五人民醫(yī)院（MDR15株）的52例肺結(jié)核患者。其中男35例，女17例，年齡18～76歲，平均（42.6±14.5）歲。52株耐藥結(jié)核分枝桿菌主要從肺結(jié)核患者的痰及肺泡灌洗液標(biāo)本培養(yǎng)分離獲得。同時(shí)，以實(shí)驗(yàn)室保存的30株敏感菌株作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)參照菌株H37Rv（ATCC27294）由江西省胸科醫(yī)院惠贈(zèng)。參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行菌株鑒定。

2.藥敏試驗(yàn)：采用世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目指南推薦的1%間接比例法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)（drug sensitivity test，DST）［8］。藥敏羅氏培養(yǎng)基（嘉偉生物制品有限公司，杭州）藥物終濃度為：異煙肼（INH）0.20μg/ml，利福平（RFP）40μg/ml，氧氟沙星（Ofx）2μg/ml，卡那霉素（Km）30μg/ml，卷曲霉素（Cm）40μg/ml。

二、基因組DNA的提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說(shuō)明書的步驟，提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA溶液約100μl（2.0～3.0μg）。

三、北京基因型菌株的鑒定

按照Chen等［9］建立的以RD105為分子標(biāo)志的定向缺失多重酶鏈聚合反應(yīng)技術(shù)（the RD105 deletion targeted multiplex PCR，DTM-PCR）對(duì)所收集的52株耐藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行北京基因型菌株鑒定。結(jié)核分枝桿菌如果存在RD105基因片段缺失則為北京基因型菌株，電泳圖上可見761 bp大小的條帶；RD105基因片段不缺失則為非北京基因型，電泳圖上可見1466 bp大小的條帶。

四、MAS-PCR方法檢測(cè)gyrA 90、94位密碼子和rrs 1401位點(diǎn)突變

目前認(rèn)為，結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生Ofx耐藥主要與gyrA基因耐藥決定區(qū)突變有關(guān)，對(duì)Km和Cm耐藥主要與rrs基因突變有關(guān)。因此，本研究針對(duì)gyrA基因90、94位密碼子和rrs 1401位點(diǎn)突變進(jìn)行MAS-PCR分析。MAS-PCR檢測(cè)的對(duì)象包括30株敏感陰性對(duì)照菌株、相應(yīng)的耐藥臨床分離菌株及實(shí)驗(yàn)參照菌株H37Rv。

1.引物設(shè)計(jì)：gyrA基因94位密碼子和rrs 1401位點(diǎn)突變檢測(cè)的引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。gyrA基因90位密碼子突變分析則根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的gyrA基因全序列（NC-000962）和點(diǎn)檢原理自行設(shè)計(jì)內(nèi)向引物I2（表1）。用于gyrA基因第94位密碼子MAS-PCR突變分析的引物包括gyrA正反向引物F、R和內(nèi)向引物I1（表1）；相應(yīng)地，gyrA基因第90位密碼子為gyrA正反向引物F、R和內(nèi)向引物I2（表1），rrs 1401位點(diǎn)為rrs正反向引物F、R和內(nèi)向引物I3（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2.PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件：參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行。

3.結(jié)果判讀：擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳120 V，30 min，0.5μg/ml EB染色，以電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)（Tanon-2500，上海天能科技有限公司）觀察結(jié)果。根據(jù)PCR原理，gyrA基因94位密碼子野生株可擴(kuò)增出427 bp和260 bp 2條片段，而突變株相應(yīng)的條帶260 bp缺失（圖1a）。類似地，gyrA基因90位密碼子野生株可見427 bp和252 bp 2條片段，突變株252 bp條帶缺失（圖1b）。rrs基因1401位點(diǎn)野生株可見481 bp和353 bp 2條片段，突變株353 bp條帶缺失（圖1c）。

表1 用于靶基因擴(kuò)增及MAS-PCR反應(yīng)的引物序列

圖1 MAS-PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌gyrA和rrs基因突變電泳圖

五、PCR-DNA測(cè)序分析

對(duì)結(jié)核分枝桿菌gyrA、gyrB和rrs基因核心突變區(qū)進(jìn)行體外擴(kuò)增，引物分別為gyrA-F、R，gyrB-F、R和rrs-F、R（表1）。退火溫度及擴(kuò)增片段大小如表1所示。PCR產(chǎn)物送深圳華大基因測(cè)序。gyrA、gyrB和rrs擴(kuò)增片段測(cè)序引物分別為gyrAR、gyrB-F和rrs-F。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用NCBI在線軟件Blast 2 Sequences（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法（當(dāng)最小理論值小于5時(shí)采用）統(tǒng)計(jì)分析計(jì)數(shù)資料（構(gòu)成比）的差異；在α= 0.05雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、耐藥表型和北京基因型菌株的鑒定

52株MDR結(jié)核分枝桿菌（其中16株XDR菌株）耐二線抗結(jié)核藥：Ofx 39株（75.00%），Km 28株（53.85%），Cm 14株（26.92%），具體見表2。

52株耐藥結(jié)核分枝桿菌中40株為北京基因型（40/52，76.92%），12株為非北京基因型（12/52，23.08%）。

二、DNA測(cè)序分析

1.gyrA和gyrB基因突變：除了參照菌株H37Rv和1株Ofx耐藥株，38株耐Ofx的臨床分離菌株及30株Ofx敏感的陰性對(duì)照菌株gyrA基因第95位點(diǎn)均存在AGC→ACC突變，第21位點(diǎn)均可見GAG→CAG錯(cuò)義突變。39株耐Ofx菌株中，32株存在gyrA基因錯(cuò)義突變，突變率為82.05%（32/39），涉及90（3/32，9.38%）、91（2/32，6.25%）及94位點(diǎn)（27/32，84.38%），其中以94位點(diǎn)GAC（天冬氨酸）→GGC（甘氨酸）突變最常見（20/32，62.50%）。只有2株耐Ofx菌株存在gyrB基因錯(cuò)義突變，突變率5.13%（2/39）；其中1株MDR菌株gyrB基因第540位點(diǎn)GAA→GAC突變的同時(shí)伴有g(shù)yrA基因第94位點(diǎn)GAC→GGC突變。突變類型和頻率詳見表2。gyrA和gyrB基因突變聯(lián)合檢測(cè)Ofx耐藥性的敏感度為84.62% （33/39），6株Ofx耐藥菌株沒有發(fā)現(xiàn)突變。

表2 52株耐藥結(jié)核分枝桿菌表型耐藥模式和耐藥基因突變類型

2.rrs基因突變：30株Km及Cm敏感的陰性對(duì)照菌株均未發(fā)現(xiàn)突變。29株耐Km或Cm結(jié)核分枝桿菌中，6株rrs基因未發(fā)現(xiàn)突變；在發(fā)生突變的23株細(xì)菌中，22株為rrs1401位點(diǎn)A→G突變，另1株為rrs1402位點(diǎn)C→T堿基替換（表2）。DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)該地區(qū)耐氨基糖苷類的MDR菌株檢出率為79.31%（23/29），以rrs-A1401G（95.65%，22/23）突變?yōu)橹鳌?/p>

3.耐藥基因突變類型與北京基因型的關(guān)系：40株北京基因型耐藥菌株中，17株發(fā)生gyrAGAC94GGC突變（42.50%，17/40），19株發(fā)生rrs-A1401G突變（47.50%，19/40）。12株非北京基因型菌株中，3株發(fā)生gyrA-GAC94GGC突變，3株發(fā)生rrs-A1401G突變。統(tǒng)計(jì)分析提示：北京基因型與Ofx耐藥相關(guān)的最常見的基因突變類型gyrAGAC94GGC無(wú)明顯相關(guān)性（χ2=1.16，P＞0.05）；北京基因型與Km及Cm耐藥相關(guān)的最常見的基因突變類型rrs-A1401G無(wú)明顯相關(guān)性（χ2=1.92，P＞0.05）。

三、MAS-PCR檢測(cè)gyrA和rrs基因點(diǎn)突變分析

1.MAS-PCR檢測(cè)gyrA基因突變：在MASPCR檢測(cè)的69株（包括30株Ofx敏感的陰性對(duì)照菌株和39株Ofx耐藥的臨床分離株）結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，30株Ofx敏感株均未提示有突變。39株耐Ofx結(jié)核分枝桿菌中，24株提示有突變（表3）。經(jīng)測(cè)序證實(shí)為94位點(diǎn)GAC→GGC或GAC→GCC突變的21株均為陽(yáng)性，而存在90位點(diǎn)GCG→GTG突變的3株也為陽(yáng)性。與比例法比較，敏感度為61.54%（24/39）；與DNA測(cè)序比較，敏感度為72.73%（24/33）。

表3 MAS-PCR和DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)二線抗結(jié)核藥耐藥性的敏感度

2.MAS-PCR檢測(cè)rrs基因突變：在MAS-PCR檢測(cè)的59株（包括30株Km或Cm敏感的陰性對(duì)照菌株和29株Km或Cm耐藥的臨床分離株）結(jié)核分枝桿菌中，30株敏感株均未提示有突變。29株耐Km或Cm菌株中，23株提示有突變（表3）。經(jīng)測(cè)序證實(shí)存在1401位點(diǎn)A→G突變的22株菌株均為MAS-PCR陽(yáng)性，而存在1402位點(diǎn)C→T突變的1株卻錯(cuò)判為1401位點(diǎn)A→G突變。與比例法比較，敏感度為79.31%（23/29）；與DNA測(cè)序比較，敏感度為100.00%（23/23）。

討 論

一、結(jié)核分枝桿菌耐二線抗結(jié)核藥物的相關(guān)基因突變特征分析

DNA測(cè)序分析提示：38株耐Ofx菌株及30株敏感陰性對(duì)照菌株的gyrA基因第95位點(diǎn)均存在AGC→ACC突變，第21位點(diǎn)均可見GAG→CAG錯(cuò)義突變。第95位點(diǎn)AGC→ACC突變?yōu)樘烊欢鄳B(tài)現(xiàn)象［11］。第21位點(diǎn)GAG→CAG突變很少報(bào)道，但最近已證實(shí)與耐藥無(wú)關(guān)，認(rèn)為是天然多態(tài)現(xiàn)象和物種進(jìn)化遺傳標(biāo)志［12］。本研究DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)MDR菌株耐Ofx的敏感度為84.62%，與其他研究報(bào)道相一致［13-14］。32株gyrA基因錯(cuò)義突變分別發(fā)生第90（9.38%）、91（6.25%）和94 （84.38%）位密碼子上，未發(fā)現(xiàn)既往文獻(xiàn)報(bào)道的第74和88位密碼子突變［11-12］。只有2株gyrB基因點(diǎn)突變陽(yáng)性。這說(shuō)明gyrA基因突變是江西地區(qū)結(jié)核分枝桿菌對(duì)氟喹諾酮產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制，以94位密碼子突變（27株）為主。本實(shí)驗(yàn)中在gyrA和gyrB基因耐藥決定區(qū)均無(wú)突變的6株耐Ofx結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。此外，DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)該地區(qū)耐氨基糖苷類的MDR菌株檢出率為79.31%（23/29），以rrs A1401G（95.65%，22/23）突變?yōu)橹鳌?/p>

有研究表明北京基因型與rpoB基因突變、katG基因第315位突變、rpsL基因第43位突變及gyrA基因第94位突變有顯著相關(guān)性［14-16］；但也有報(bào)道北京基因型與結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變位點(diǎn)分布并無(wú)相關(guān)性［17-18］；本研究結(jié)果支持后者。各地報(bào)道的北京基因型與結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變種類的相關(guān)性有所不同，其原因可能是區(qū)域差異所致［18］。此外，本研究樣本選擇局限于耐多藥結(jié)核分枝桿菌以及樣本量偏小，也是影響研究結(jié)果的重要因素。

二、MAS-PCR技術(shù)檢測(cè)原理及效能分析

MAS-PCR方法常用于已知突變基因的檢測(cè)。其實(shí)驗(yàn)原理基于耐熱Taq DNA聚合酶缺乏3′→5′外切酶校正活性，在同一個(gè)反應(yīng)體系中設(shè)計(jì)兩條外引物和一條內(nèi)引物，其中內(nèi)引物的3′端末端正好對(duì)應(yīng)待測(cè)突變位點(diǎn)，若此堿基對(duì)形成錯(cuò)配，鏈延伸反應(yīng)就會(huì)因3′，5′-磷酸二酯鍵形成障礙而受阻。對(duì)于野生型菌株，3條引物均可以起作用，合成2種PCR產(chǎn)物；而當(dāng)待測(cè)位點(diǎn)第1或第2個(gè)核苷酸發(fā)生突變時(shí)，在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下，內(nèi)引物作用的效率大大降低，因此只能見到外引物合成的長(zhǎng)片段［19-20］。與常規(guī)藥敏結(jié)果比較，本研究MAS-PCR對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥株的檢出率為61.54%，這一結(jié)果稍高于夏強(qiáng)等［20］的研究報(bào)道；與DNA測(cè)序敏感度（84.62%）比較，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.05，P＜0.05）。與比例法和DNA測(cè)序相比，MAS-PCR對(duì)于耐氨基糖苷類結(jié)核分枝桿菌的檢出率分別為79.31%和100.00%。相對(duì)Ofx，MAS-PCR對(duì)耐Km或Cm結(jié)核分枝桿菌顯示了更好的敏感度。其原因在于結(jié)核分枝桿菌對(duì)Km、Cm和Ofx耐藥機(jī)制不同造成的，Km或Cm耐藥相關(guān)的rrs基因突變類型較單一，而Ofx耐藥相關(guān)的gyrA基因突變位點(diǎn)分布及頻率變化則復(fù)雜得多。

三、MAS-PCR技術(shù)檢測(cè)效能的改進(jìn)措施及缺陷分析

不同地區(qū)耐藥相關(guān)基因突變類型和頻率不盡相同，因此，MAS-PCR檢測(cè)敏感度的區(qū)域差異可能很大。本研究DNA測(cè)序顯示江西省39株耐Ofx結(jié)核分枝桿菌菌株中有5株存在gyrA基因第94位點(diǎn)GAC→AAC突變，如果針對(duì)這種突變進(jìn)行引物設(shè)計(jì)將之覆蓋，MAS-PCR的敏感度可能將從61.54%（24/39）提高到74.36%（29/39）。此外，1株rrs1402位點(diǎn)C→T突變通過(guò)MAS-PCR卻錯(cuò)判為1401位點(diǎn)A→G突變，所幸rrs1402位點(diǎn)C→T突變引起了結(jié)核分枝桿菌 Km耐藥［21］。如果其他與耐藥無(wú)關(guān)的基因多態(tài)性被擴(kuò)增，就會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。此外，由于分子生物學(xué)方法本身的限制，DNA測(cè)序和MAS-PCR分析結(jié)果陰性的樣本并不能排除表型耐藥的可能［22］。

目前，DNA測(cè)序技術(shù)是分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)。MAS-PCR方法不能明確耐藥相關(guān)基因突變的堿基置換，敏感度也不及DNA測(cè)序技術(shù)，但它的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，不需要昂貴的儀器，幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以得到結(jié)果［6］。此外，常規(guī)藥敏檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)（數(shù)周），延誤患者治療，導(dǎo)致耐藥發(fā)生和結(jié)核傳播的機(jī)會(huì)增加［23-24］。因此，在結(jié)核病高發(fā)和耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻的區(qū)域，對(duì)于快速診斷耐二線抗結(jié)核藥的結(jié)核病、指導(dǎo)臨床合理用藥，MAS-PCR不失為一種有應(yīng)用價(jià)值的檢測(cè)手段。

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Molecular characteristics of the second-line antituberculosis drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from Jiangxi province

YUAN Xiao-liang*，ZHANG Tian-tuo，ZHU Jia-xin，ZHENG Wen-zheng，LEI Jian-ping，TU Shao-hua，LUO Yi-jun，LIU Wei-you.*Department of Respiratory Medicine，the 1st Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China

ZHANG Tian-tuo，Email：zhtituli@163.com

Objective To initially ascertain molecular characteristics of the second-line antituberculosis drugresistant M.tuberculosis clinical isolates in Jiangxi，and to evaluate the feasibility of multiplex allele-specific polymerase chain reaction（MAS-PCR）assay for the detection of the second-line drug resistance in M.tuberculosis clinical isolates.Methods Fifty-two second-line drug-resistant isolates and 30 pan-susceptible isolates from Jiangxi province were analyzed for gene mutations related to the second-line drug resistance using MAS-PCR and DNA sequencing.Results DNA sequencing indicated that 32 of 39 ofloxacin（Ofx）-resistant isolates displayed missense mutations in gyrA gene，and the most common mutations were observed at codon 94（n=27），and only 2 isolates showed single-point mutation in gyrB gene.In addition，22 of 29 kanamycin（Km）-or capreomycin（Cm）-resistant isolates had an A-to-G transition at nucleotide position 1401 of rrs gene.It is shown that the Beijing genotype was predominant（76.92%，40/52）among the 52 drug-resistant strains.Of 40 Beijing genotype strains，17 strains （42.50%）displayed gyrA-GAC94GGC mutations，and 19 strains（47.50%）showed rrs-A1401G mutations.No relationship could be demonstrated between Beijing genotype and gyrA-GAC94GGC or rrs-A1401G mutations（χ2= 1.16，1.92，P value＞0.05）.In comparison with the phenotypic data，the sensitivities of the detection of Ofx resistance，and Km or Cm resistance using MAS-PCR were 61.54%（24/39）and 79.31%（23/29）respectively.Conclusion In Jiangxi province，gyrA mutation is the main molecular mechanism of Ofx resistance in M.tuberculosis，and an A1401G mutation in the rrs geneis the main cause of Km or Cm resistance.MAS-PCR，an assay with technical simplicity，short turnaround time，and low cost，could be useful for screening second-line drug-resistant M.tuberculosis，particularly in resource-limited areas with a high prevalence of tuberculosis and drug resistance.

Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance，bacterial； Antibiotics，antitubercular； Kanamycin； Capreomycin sulfate； Polymerase chain reaction； Jiangxi

2013-04-01）

（本文編輯：張曉進(jìn)）

341000贛州，贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科（袁小亮、劉惟優(yōu)）；中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸科（張?zhí)焱小⒅旒臆?、鄭文?zhēng)）；江西省胸科醫(yī)院結(jié)核科（雷建平），檢驗(yàn)科（涂少華）；江西省贛州市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（羅一鈞）

張?zhí)焱?，Email：zhtituli@163.com