杜志強(qiáng)，王建英

（內(nèi)蒙古科技大學(xué)數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010）

凡納對(duì)蝦是重要的甲殼類動(dòng)物，也是目前研究無脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)的重要模式生物。在無脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)中，直接發(fā)揮抗菌作用的蛋白質(zhì)分子被稱為免疫效應(yīng)分子；其中，就包括溶菌酶。溶菌酶是一種能夠直接破壞細(xì)菌細(xì)胞壁組分之間的β-1，4-糖苷鍵的物質(zhì)，可以使細(xì)菌細(xì)胞壁發(fā)生水解、內(nèi)容物外泄而死亡[1]。所以，研究清楚溶菌酶基因的免疫機(jī)制，有助于更好的開展對(duì)蝦類細(xì)菌、病毒疾病的防治工作。本文以凡納對(duì)蝦的溶菌酶基因作為研究對(duì)象，克隆該基因的cDNA 序列，并且對(duì)基因序列的同源性、分子進(jìn)化上的親緣關(guān)系、分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

凡納對(duì)蝦于包頭市友誼水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)買冷凍保存的凍蝦。在實(shí)驗(yàn)室待蝦體完全溶解之后，采集肝胰腺、鰓等組織，用于提取總RNA。

1.1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物DNA 回收試劑盒、總RNA 提取試劑盒（TRizol Total RNA Reagent 試劑盒）、cDNA 第一鏈合成試劑盒、T-載體PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒、DEPC、氨芐青霉素鈉、DL2000 DNA Marker：購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；其他有機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取

參照使用說明書，利用TRizol 總RNA 提取試劑盒提取凡納對(duì)蝦的肝胰腺和鰓等組織的總RNA[2]。檢測(cè)RNA 的質(zhì)量后，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA 的合成

按照cDNA 第一鏈合成試劑盒的操作說明[3]，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為進(jìn)行目的基因擴(kuò)增的模板，反轉(zhuǎn)錄過程使用的前引物為5′ PCR prime（5′-tacggctgcgagaagacgacagaa-3′），后引物為3′anchor R（5′-gaccacgcgtatcgatgtcgact16（a/c/g）-3′）。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank 中公布的凡納對(duì)蝦溶菌酶基因（Lva-lys）的部分cDNA 序列，設(shè)計(jì)目的基因特異的克隆引物F（5′-atgagggtgcttcctctggc-3′）和R（5′-aattc gattgttgtaaaaatgg-3′），用來擴(kuò)增目的基因片段cDNA 的完整開放閱讀框（ORF）序列。

1.2.4 目的片段的PCR 擴(kuò)增

利用前引物F 和反轉(zhuǎn)錄使用的后引物3′anchor R引物配對(duì)，來擴(kuò)增目的基因的ORF 的3′端序列；同時(shí)利用后引物R 和反轉(zhuǎn)錄使用的前引物5′PCR primer引物來擴(kuò)增目的基因ORF 的5`端序列，以凡納對(duì)蝦中提取的各種RNA 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 條件為[4]：95 ℃3 min、94 ℃30 s、54 ℃30 s、72 ℃30 s、35 個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸5 min。

1.2.5 重組載體的構(gòu)建與序列測(cè)定

使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因片段的PCR 擴(kuò)增結(jié)果，利用PCR 產(chǎn)物DNA 回收試劑盒（普通離心柱型）進(jìn)行回收、純化；之后，參照T-載體PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒的使用說明書，將基因片段克隆到T-載體中，通過熱激法將重組子轉(zhuǎn)化到DH5α 宿主菌感受態(tài)細(xì)胞中[5]；經(jīng)過藍(lán)白斑篩選之后，將陽性克隆子送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序部，進(jìn)行基因片段的序列測(cè)定。

1.3 生物信息學(xué)分析方法

1.3.1 氨基酸序列比對(duì)

將克隆得到的凡納對(duì)蝦溶菌酶基因（Lva-lys）cDNA 的ORF 序列輸入NCBI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行相關(guān)基因序列比對(duì)（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/）。用Expasy在線軟件對(duì)這一基因的cDNA 的ORF 序列進(jìn)行翻譯，并對(duì)翻譯的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的預(yù)測(cè)（http：//au.expasy.org）。蛋白質(zhì)序列信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)在SMART（Simple Modular Architecture Research Toll）網(wǎng)站上進(jìn)（http：//smart.embl-heidelberg.de/）[6]。氨基酸序列比對(duì)利用分子生物學(xué)軟件DNAMAN 完成。

1.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制

根據(jù)NCBI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行的凡納對(duì)蝦溶菌酶基因（Lva-lys）相關(guān)基因序列比對(duì)的結(jié)果，選擇物種相近的一些生物的溶菌酶基因，進(jìn)行氨基酸序列分析之后，利用分子生物學(xué)軟件MEGA 4.0 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制。

1.3.3 分子結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

根據(jù)Expasy 在線軟件對(duì)凡納對(duì)蝦溶菌酶基因的cDNA 序列進(jìn)行翻譯的結(jié)果，利用蛋白質(zhì)分子初級(jí)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具SMART 網(wǎng)站進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)的初步預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆和序列分析結(jié)果

凡納對(duì)蝦溶菌酶基因的cDNA 序列以及演繹的氨基酸序列，見圖1。

圖1 凡納對(duì)蝦溶菌酶基因的cDNA 序列以及演繹的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence and encoding amino acids sequence of Lva-lys gene

根據(jù)序列測(cè)定結(jié)果，進(jìn)行序列拼接，得到了凡納對(duì)蝦溶菌酶基因cDNA 序列完整的開放閱讀框（ORF）。結(jié)果顯示：Lva-lys 基因的ORF 包括477 bp；演繹出158 個(gè)氨基酸。在氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)中，N 末端的18 個(gè)氨基酸殘基形成信號(hào)肽序列（用下劃線標(biāo)注），第19 個(gè)至第148 個(gè)氨基酸殘基形成了一個(gè)LYZ1 結(jié)構(gòu)域（用方框標(biāo)注）。在這個(gè)溶菌酶的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域中，包括8 個(gè)保守存在的半胱氨酸殘基（用黑色三角形標(biāo)注），以及組成溶菌酶活性中心的2 個(gè)氨基酸殘基——Glu51和Asp68（用黑色五角星標(biāo)注）。這個(gè)重要的LYZ1結(jié)構(gòu)域以及結(jié)構(gòu)域里面的8 個(gè)保守存在的半胱氨酸殘基和2 個(gè)重要的活性位點(diǎn)，都是溶菌酶發(fā)揮抗菌作用的特殊結(jié)構(gòu)。

2.2 氨基酸序列的同源性分析

凡納對(duì)蝦溶菌酶基因與其他物種的溶菌酶基因的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，見圖2。

將克隆得到的凡納對(duì)蝦溶菌酶基因（Lva-lys）的cDNA 序列，在NCBI 網(wǎng)上進(jìn)行基因序列BLAST 比對(duì)。從比對(duì)結(jié)果中，我們選擇了核苷酸序列同源性較高的6 種相近物種的溶菌酶基因，進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對(duì)分析。我們發(fā)現(xiàn)：凡納對(duì)蝦的溶菌酶分子（Lva-Lys）與中國(guó)明對(duì)蝦溶菌酶（Fch-Lys）、印度明對(duì)蝦溶菌酶（Fin-Lys）、南美藍(lán)對(duì)蝦溶菌酶（Lst-Lys）、日本囊對(duì)蝦溶菌酶（Mja-Lys）、羅氏沼蝦溶菌酶（Mro-Lys）、斑節(jié)對(duì)蝦溶菌酶（Pmo-Lys）在氨基酸序列上具有較高的同源性，相似性達(dá)到了92.41%。而且，在這六種溶菌酶分子中，都保守地存在著8 個(gè)半胱氨酸殘基和兩個(gè)活性位點(diǎn)Glu51和Asp68。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Lva-Lys 與其他溶菌酶分子的親緣關(guān)系

在NCBI 網(wǎng)上進(jìn)行基因序列BLAST 比對(duì)之后，我們選擇與凡納對(duì)蝦溶菌酶基因的序列同源性較高、而且物種相近的10 種溶菌酶分子，利用分子生物學(xué)軟件MEGA 4.0 進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的繪制，結(jié)果如圖3。

圖3 Lva-Lys 分子與其他溶菌酶分子的進(jìn)化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis between Lva-Lys and other lysozyme molecules

在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，凡納對(duì)蝦的溶菌酶分子（Lva-Lys）與中國(guó)明對(duì)蝦溶菌酶（Fch-Lys）、印度明對(duì)蝦溶菌酶（Fin-Lys）、羅氏沼蝦溶菌酶（Mro-Lys）、斑節(jié)對(duì)蝦溶菌酶（Pmo-Lys）、南美藍(lán)對(duì)蝦溶菌酶（Lst-Lys）、日本囊對(duì)蝦溶菌酶（Mja-Lys）分子聚在了一個(gè)分支上，而且凡納對(duì)蝦的溶菌酶分子（Lva-Lys）與南美藍(lán)對(duì)蝦溶菌酶分子（Lst-Lys）的親緣關(guān)系最近。

2.4 Lva-lys 分子的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具SMART 網(wǎng)站，進(jìn)行凡納對(duì)蝦溶菌酶分子的分子結(jié)構(gòu)初步預(yù)測(cè)，Lva-Lys 分子結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果，見圖4。

圖4 Lva-Lys 分子結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 The prediction result of Lva-Lys molecule structure

分子結(jié)構(gòu)如圖4 所示，凡納對(duì)蝦溶菌酶分子具有一個(gè)經(jīng)典的溶菌酶分子結(jié)構(gòu)域；根據(jù)氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)在這個(gè)溶菌酶分子的LYZ1 結(jié)構(gòu)域中，在固定的位置保守地存在著8 個(gè)半胱氨酸殘基，它們可以形成4 對(duì)二硫鍵來穩(wěn)定這個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)域。另外，在LYZ1 結(jié)構(gòu)域中，存在著溶菌酶活性中心的2 個(gè)活性位點(diǎn)——Glu51和Asp68；正是這2 個(gè)活性位點(diǎn)發(fā)揮了水解細(xì)菌細(xì)胞壁β-1，4-糖苷鍵的功能[7]，而且在不同物種的溶菌酶分子中，它們十分保守。

3 結(jié)論與討論

通過cDNA 序列的克隆，我們獲得了凡納對(duì)蝦溶菌酶基因完整的開放閱讀框，經(jīng)過核苷酸序列以及氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)溶菌酶分子在不同物種中序列同源性較高；而且，關(guān)鍵的8 個(gè)半胱氨酸殘基以及2 個(gè)活性位點(diǎn)，十分保守地存在著，這也是溶菌酶分子能夠廣泛地在不同物種中發(fā)揮抗菌作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過對(duì)分子結(jié)構(gòu)的研究與分析，我們推測(cè)：溶菌酶基因在凡納對(duì)蝦的先天免疫系統(tǒng)中應(yīng)該發(fā)揮著重要的抗菌功能。而且，目前所做的這些理論研究工作，將為下一步基因功能的研究提供了重要的理論基礎(chǔ)，有助于促進(jìn)無脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)的不斷完善。

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