韓曉紅，李 磊，段春紅

（武漢生物工程學(xué)院 生物工程系，湖北 武漢430415）

1 引言

紅豆杉（Taxus）是紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物的總稱[1]，從中提取的紫杉醇以其獨(dú)特的治癌機(jī)理和療效顯著而風(fēng)靡全球，從而促成了世界性開發(fā)紅豆杉和提取紫杉醇的新潮流。全球共有11種紅豆杉，分布于北半球的溫帶及亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)有4個(gè)品種及1個(gè)變種：東北紅豆杉（T.cuspidata）、云南紅豆杉（T.yunnanensis）、西藏紅豆杉（T.wallichiana）、中國(guó)紅豆杉 （T.chinensi）、南 方 紅豆 杉 （T.chinensis varmairei），其中中國(guó)紅豆杉和南方紅豆杉為我國(guó)所特有[2]。

由于紅豆杉生長(zhǎng)極其緩慢，種子存在休眠與后熟難以繁殖，內(nèi)生菌種類與數(shù)量多，愈傷組織易褐變及生長(zhǎng)不穩(wěn)定和紫杉醇市場(chǎng)需求大、利潤(rùn)高，因此通過(guò)體外植物組織培養(yǎng)獲得試管苗運(yùn)用于觀賞盆景、工業(yè)木材和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)高產(chǎn)紫杉醇都有巨大的科研、商業(yè)前景。本試驗(yàn)以南方紅豆杉的嫩莖為外植體，探討了不同激素組合和濃度對(duì)愈傷化誘導(dǎo)及其愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)的影響，為生產(chǎn)紅豆杉試管苗和實(shí)現(xiàn)紫杉醇工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)參考。

2 材料與方法

南方紅豆杉無(wú)菌嫩莖由武漢生物工程學(xué)院植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室提供。

2.1 不同激素對(duì)于紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)影響試驗(yàn)

截取無(wú)菌嫩莖1cm左右，以B5＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L＋AC1g/L＋酪蛋白1g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加激素2，4－D、6－BA和 NAA（組合見(jiàn)表1），探求其對(duì)嫩莖愈傷化的影響，每只試管接種1個(gè)莖段，每個(gè)處理重復(fù)16次。觀察統(tǒng)計(jì)30d和60d后的愈傷化誘導(dǎo)情況，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率。其中，愈傷組織誘導(dǎo)率＝（愈傷化總數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%，褐變率＝（褐變數(shù)/愈傷化的外植體總數(shù)）×100%。

表1 紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的激素設(shè)計(jì)

2.2 不同激素對(duì)紅豆杉愈傷組織細(xì)胞繼代增殖影響

2.2.1 探討NAA對(duì)愈傷組織繼代增殖的影響

在試驗(yàn)基礎(chǔ)上，提高NAA濃度，并搭配KT0.5mg/L，選 用 NAA3.0mg/L、NAA4.0mg/L、NAA5.0mg/L分別進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)試驗(yàn)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為B，5（去掉 Cu2＋的 B5培養(yǎng)基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L，每個(gè)處理接種愈傷組織16只試管，培養(yǎng)30d觀察愈傷生長(zhǎng)情況并稱其鮮重，并計(jì)算愈傷組織生長(zhǎng)值和愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)。其中，愈傷組織生長(zhǎng)值（mg）＝收獲鮮重－接種鮮重，愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)＝（收獲鮮重－接種鮮重）/接種鮮重。

2.2.2 探討KT對(duì)愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響

在試驗(yàn)確定NAA濃度基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)KT濃度梯度KT0mg/L，KT0.5mg/L，KT1.0mg/L，從而確定對(duì)于紅豆杉愈傷組織增殖的最佳KT濃度。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為B，5（去掉Cu2＋的B5培養(yǎng)基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L，每個(gè)處理重復(fù)16次，培養(yǎng)30d稱其鮮重，計(jì)算愈傷組織生長(zhǎng)指數(shù)。

3 結(jié)果分析

3.1 不同激素對(duì)于紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選用不同濃度的2，4－D與6－BA組合、NAA與6－BA組合進(jìn)行嫩莖愈傷化誘導(dǎo)試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)其30 d、60 d的誘導(dǎo)率及褐變率（表2）。

表2 激素對(duì)紅豆杉嫩莖誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由表2可知，2號(hào)培養(yǎng)基（2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L）中愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100%，褐變率較低，比較適合誘導(dǎo)紅豆杉嫩莖的愈傷化。比較兩組激素搭配，可見(jiàn)生長(zhǎng)素2，4－D比NAA誘導(dǎo)愈傷化的作用效果更明顯（圖1），但高濃度的2，4－D容易導(dǎo)致褐變，因此誘導(dǎo)紅豆杉嫩莖愈傷化的最佳激素組合為：2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L。

圖1 愈傷化的嫩莖（2，4－D2.0＋6－BA0.5）

3.2 不同激素對(duì)紅豆杉愈傷組織繼代增殖影響

3.2.1 NAA對(duì)于紅豆杉愈傷組織增殖的影響

由誘導(dǎo)試驗(yàn)可知愈傷組織長(zhǎng)期處于2，4－D的培養(yǎng)基上易褐化和引起細(xì)胞癌變；同時(shí)相對(duì)于6－BA，KT對(duì)減輕褐化有更明顯的效果[3]，且由表2可知低濃度的NAA（NAA1.0和NAA2.0）對(duì)促進(jìn)外植體愈傷化沒(méi)有明顯的效果，因此以B，5（去掉Cu2＋的B5培養(yǎng)基）＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加較高濃度的NAA（濃度梯度為：NAA3.0mg/L、NAA4.0mg/L、NAA5.0mg/L），同時(shí)搭配KT0.5mg/L進(jìn)行愈傷組織的增殖試驗(yàn)，30 d后對(duì)增殖結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其生長(zhǎng)指數(shù)見(jiàn)表3。

表3 NAA對(duì)愈傷組織增殖的影響

培養(yǎng)30d后，在NAA濃度為4.0mg/L時(shí)，愈傷組織增殖效果最好（圖2），平均生長(zhǎng)值達(dá)到2.322g，由此可知NAA濃度在4.0mg/L時(shí)是南方紅豆杉愈傷組織增殖的最佳濃度。

圖2 增殖培養(yǎng)的愈傷組織

3.2.2 KT對(duì)紅豆杉愈傷組織增殖的影響

在篩選出增殖的最佳NAA濃度的基礎(chǔ)上，探求不同濃度的 KT（KT 的濃度梯度為：0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L）對(duì)愈傷組織增殖培養(yǎng)的影響，培養(yǎng)一個(gè)月后觀察愈傷組織增值情況并稱重，其生長(zhǎng)指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表4。其中當(dāng)KT濃度為0.5mg/L時(shí)，愈傷組織增殖效果最好，生長(zhǎng)指數(shù)可達(dá)0.983±0.030，由此可知KT濃度為0.5mg/L時(shí)，愈傷組織增殖效果最好。

表4 KT對(duì)愈傷組織繼代培養(yǎng)影響試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)語(yǔ)

盛長(zhǎng)忠等[4]研究發(fā)現(xiàn)，2，4－D比 NAA更有利于愈傷組織的形成，以2.0mg/L時(shí)效果最好。培養(yǎng)基中添加CA（酪蛋白）、PHE和乙酸鈉能促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)和紫杉醇積累，其中CA0.5mg/L時(shí)生長(zhǎng)量最大。李斌連等[5]認(rèn)為，從芽誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織顏色較淺，出愈時(shí)間較早，而從莖段和葉片誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色濃綠，以后繼代過(guò)程中易發(fā)生褐化，因此，側(cè)芽是誘導(dǎo)愈傷組織最佳的外植體。低濃度的CA（酪蛋白，0.1%～0.5%）能參與細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的代謝活動(dòng)，促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)，濃度較高時(shí)，不僅抑制天然氨基酸的正常合成，而且CA中過(guò)量的芳香族氨基酸進(jìn)入次級(jí)代謝途徑，產(chǎn)生許多酚類物質(zhì)，使愈傷組織褐化，抑制其生長(zhǎng)[6]。本試驗(yàn)以嫩莖為外植體，愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：B5＋2，4－D2.0mg/L＋6－BA0.5mg/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L＋AC1g/L＋酪蛋白1g/L；繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為：B，5（去掉 Cu2＋的B5培養(yǎng)基）＋NAA4.0mg/L＋KT0.5mg/L＋蔗糖20g/L＋瓊脂8g/L＋AC0.5g/L＋酪蛋白1g/L。獲得穩(wěn)定的愈傷組織是工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵所在，在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)較高濃度的2，4－D能短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)外植體愈傷化，但在其上面繼續(xù)培養(yǎng)便很快褐化、死亡。如果把2，4－D培養(yǎng)基上剛形成的愈傷化細(xì)胞團(tuán)立即轉(zhuǎn)移到較高濃度的NAA培養(yǎng)基上便能防止細(xì)胞褐化，以后每隔一個(gè)月左右繼代一次便可使愈傷組織持續(xù)穩(wěn)定生長(zhǎng)，便可獲得穩(wěn)定的愈傷組織，為實(shí)際生產(chǎn)提供了一定的技術(shù)參考。

[1]梁珍海，劉根林，徐 鋒.紅豆杉屬植物組織培養(yǎng)及其快速繁殖研究綜述[J].江蘇林業(yè)科技，2001，28（3）：45～47.

[2]包維楷，陳慶恒.中國(guó)的紅豆杉資源及其開發(fā)研究現(xiàn)狀與發(fā)展對(duì)策[J].自然資源學(xué)報(bào)，1998，13（4）：375～380.

[3]王 水，賈勇炯，魏 峰，等.云南紅豆杉的組織培養(yǎng)及植株再生[J].云南植物研究，1997，19（4）：407～410.

[4]盛長(zhǎng)忠，王淑芳.南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)研究[J].中草藥，2000，31（2）：57～59.

[5]李斌連，邱 萃，劉金仙，等.南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)體系的建立[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，35（5）：515～518.

[6]甘煩遠(yuǎn)，鄭光植.紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)的研究[J].云南植物研究，1996，18（2）：134～138.