楊貝貝，曹 棟，耿亞男，聶新艷

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122)

脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙分子層組成，內(nèi)部為水相的閉合囊泡，在模擬生物膜、藥物載體、反應(yīng)微環(huán)境中都有廣泛應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)外制備脂質(zhì)體，大多會(huì)添加一定比例的膽固醇改善脂質(zhì)體性質(zhì)。膽固醇可以減慢氧化磷脂的遷移［1］，抑制溶血磷脂形成導(dǎo)致的膜滲漏［2］。Smith E A 等［3］研究表明，膽固醇會(huì)影響脂質(zhì)體膜的通透性、分子有序性、彈性、取向性、和分子間的空隙大小。膽固醇還可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性，提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性［4］。但高膽固醇會(huì)引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等健康問(wèn)題，隨著人們對(duì)健康食品的要求提高，可能會(huì)限制脂質(zhì)體在食品藥品中的應(yīng)用。植物甾醇結(jié)構(gòu)與膽固醇類(lèi)似，不僅可以影響脂質(zhì)體膜上磷脂分子聚集，調(diào)節(jié)膜對(duì)小分子物質(zhì)的通透性［5］，改變膜的表面性質(zhì)［6］，還可以減小膽固醇的腸道吸收［7］。本文主要通過(guò)研究不同甾醇對(duì)卵磷脂脂質(zhì)體粒徑大小、粒徑分布、氧化穩(wěn)定性、流動(dòng)性、雙分子層內(nèi)部分子極性的影響，探討植物甾醇能否替代膽固醇改善脂質(zhì)體的膜性質(zhì)，促進(jìn)脂質(zhì)體在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲醇、三氯甲烷、無(wú)水乙醇、膽固醇、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、濃鹽酸 均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn);β－谷固醇(＞95%)、豆甾醇(＞95%) 阿拉丁試劑有限公司;大豆磷脂、大豆植物甾醇 江蘇曼氏生物科技有限公司;芘(99.0%)、1，6－二苯基－1，3，5－己三烯(DPH)Sigma－Aldrich公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、XMTE－2000 數(shù)顯恒溫水浴鍋、SHB－IIIA循環(huán)水式多用真空泵 南京予凱儀器設(shè)備有限公司;Mettler AL－204電子精密天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;F－7000熒光光譜儀 日本Hitach公司;Zetasizer nano ZS納米粒度儀 英國(guó)Malvern公司;KJ－300超聲波發(fā)生器 無(wú)錫市科潔超聲電子設(shè)備有限公司;WEZ UV－2010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司;78 HW－1型恒溫磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂質(zhì)體制備 取0.02g大豆卵磷脂，分別加入磷脂摩爾質(zhì)量0%、5%、15%、25%、50%的甾醇，溶于30mL氯仿/甲醇(2∶1)混合溶液中，放入玻璃珠，45℃、40r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h，在瓶?jī)?nèi)壁形成一層薄膜。然后用5mL磷酸鹽緩沖液(10mol/L，pH7.4)水化脂質(zhì)薄膜，形成5mL粗脂質(zhì)懸浮液，磁力攪拌30min，超聲15min，得到脂質(zhì)體懸濁液。

1.2.2 脂質(zhì)體粒徑大小測(cè)定 樣品槽經(jīng)樣品溶液潤(rùn)洗后，加入脂質(zhì)體懸浮液，用ZS納米粒度儀測(cè)定粒徑大小，測(cè)量溫度:25℃，分散介質(zhì):H2O，平衡時(shí)間:60s。分別測(cè)定添加不同比例膽固醇的脂質(zhì)體粒徑大小。

1.2.3 膜抗氧化性測(cè)定 取30g三氯乙酸，0.75g硫代巴比妥酸加入到200mL 0.25mol/L的鹽酸溶液中，微熱溶解，然后取5mL混合溶液和1mL的脂質(zhì)體溶液于試管中，水浴 30min，在 5000r/min下離心10min，取上清液在532nm測(cè)定吸光度。分別制備摩爾百分比15%的甾醇－脂質(zhì)體，在4℃條件下冷藏，用硫代巴比妥酸法測(cè)定不同貯藏時(shí)間的吸光值變化。

1.2.4 膜微極性的測(cè)定 配制4×10－7mol/L芘的丙酮溶液，取0.1mL的芘溶液于試管中，揮發(fā)丙酮，加入5mL稀釋5倍的不同甾醇－脂質(zhì)體溶液，超聲1h，放置12h，分別在激發(fā)波長(zhǎng)338nm，發(fā)射波長(zhǎng)373nm，384nm 時(shí)測(cè)定熒光強(qiáng)度［8］。

1.2.5 膜流動(dòng)性的測(cè)定 用磷酸鹽緩沖液配制2×10－6mol/L的DPH溶液，取1mL DPH溶液加入到5mL稀釋5倍的脂質(zhì)體溶液中，平衡12h，在 λEx=360nm，λEm=430nm時(shí)測(cè)定熒光強(qiáng)度。按公式P=(F‖－GF⊥)/(F‖+GF⊥)計(jì)算偏振度，其中‖代表激發(fā)與發(fā)射偏振器平行，⊥代表激發(fā)與發(fā)射偏振器垂直，G為光柵校正因子。已知偏振度越大，流動(dòng)性越?。?］。制備摩爾百分比15%的甾醇－脂質(zhì)體，在25℃和55℃下測(cè)定偏振度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度甾醇對(duì)脂質(zhì)體粒徑的影響

不同粒徑大小的脂質(zhì)體應(yīng)用范圍不同，一般情況下粒徑小的脂質(zhì)體穩(wěn)定性較好，但由于體積的減小，其包埋的有效成分也會(huì)減少。加入甾醇后，脂質(zhì)體一般會(huì)增大，而甾醇與磷脂間的相互作用可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

2.1.1 膽固醇對(duì)脂質(zhì)體粒徑的影響 膽固醇－脂質(zhì)體的粒徑大小和分布結(jié)果分別如圖1、圖2所示。

圖1 膽固醇含量對(duì)脂質(zhì)體粒徑大小的影響Fig.1 Effect of different amount of cholesterol on particle size of liposome

圖2 膽固醇－脂質(zhì)體粒徑分布Fig.2 The particle size distribution of cholesterol－liposome

由圖1、圖2可知，未添加膽固醇的脂質(zhì)體，粒徑分布較寬，在10～100nm處有個(gè)分布很寬的小峰;添加5%膽固醇時(shí)脂質(zhì)體粒徑減小，分布變較均勻，可能是少量的膽固醇加入，減小了磷脂雙分子層之間空隙，從而使得脂質(zhì)體的粒徑略微減小。當(dāng)膽固醇含量提高到15%，脂質(zhì)體粒徑變大，分布更加均勻，這說(shuō)明膽固醇較均勻地嵌入，利于脂質(zhì)體膜的形成。隨著膽固醇含量進(jìn)一步提高，脂質(zhì)體粒徑繼續(xù)增大，但是分布變的不均勻，說(shuō)明過(guò)多的膽固醇存在又會(huì)不均勻地嵌在脂質(zhì)體膜中。

2.1.2 β－谷固醇對(duì)脂質(zhì)體粒徑的影響 β－谷甾醇－脂質(zhì)體的粒徑大小和分布結(jié)果分別如圖3、圖4所示。

圖3 β－谷甾醇醇含量對(duì)脂質(zhì)體粒徑大小的影響Fig.3 Effect of different amount of β－sitosterol on particle size of liposome

圖4 β－谷甾醇－脂質(zhì)體粒徑分布Fig.4 The particle size distribution of β－ sitosterol－ liposome

由圖3可知，隨著β－谷甾醇含量的提高，脂質(zhì)體粒徑大小的變化與膽固醇的影響相似，但是β－谷甾醇－脂質(zhì)體的粒徑增大程度比膽固醇－脂質(zhì)體的要小;由圖4可知，β－谷甾醇－脂質(zhì)體多分散指數(shù)更小，分布的更均勻，這可能是由于β－谷甾醇比膽固醇更好的嵌入雙分子層。

2.1.3 豆固醇對(duì)脂質(zhì)體粒徑的影響 豆甾醇－脂質(zhì)體的粒徑大小和分布結(jié)果分別如圖5、圖6所示。

圖5 豆甾醇含量對(duì)脂質(zhì)體粒徑大小的影響Fig.5 Effect of different amount of stigmasterol on particle size of liposome

圖6 豆甾醇－脂質(zhì)體粒徑分布Fig.6 The particle size distribution of stigmasterol－liposome

由圖5、圖6可知，隨著豆甾醇含量提高，脂質(zhì)體的粒徑逐漸增大，但增大程度比膽固醇與β－谷甾醇的都要高。當(dāng)豆甾醇摩爾百分比0～15%時(shí)，脂質(zhì)體分布情況變化不大，但是豆甾醇濃度繼續(xù)增加時(shí)，分布變的不均勻，在大于1000nm處也有分布，這可能是由于在脂質(zhì)體的形成過(guò)程中，粒徑較大時(shí)失去了原有的平衡，從而使得脂質(zhì)體破裂和重組。

2.1.4 大豆植物甾醇對(duì)脂質(zhì)體粒徑的影響 大豆植物甾醇－脂質(zhì)體的粒徑大小和分布結(jié)果分別如圖7、圖8所示。

圖7 大豆植物甾醇含量對(duì)脂質(zhì)體粒徑大小的影響Fig.7 Effect of different amount of soybean phytosterols on particle size of liposome

圖8 大豆植物甾醇－脂質(zhì)體粒徑分布Fig.8 The particle size distribution of soybean phytosterols－liposome

由圖7、圖8可知，隨著大豆植物甾醇含量提高，脂質(zhì)體粒徑也逐漸增大，但是增大的趨勢(shì)相對(duì)不明顯。從粒徑分布上看，在高濃度時(shí)，大豆植物甾醇－脂質(zhì)體的分布不如β－谷甾醇的均勻，但是比豆甾醇要均勻的多，這是由于大豆植物甾醇中，β－谷甾醇占多數(shù)。

2.2 甾醇－脂質(zhì)體氧化穩(wěn)定性

丙二醛(MDA)是多不飽和脂肪酸鏈斷裂形成的產(chǎn)物之一，可以與硫代巴比妥酸發(fā)生成色反應(yīng)，在532nm處比色測(cè)定，可檢測(cè)丙二醛相對(duì)含量的變化，從而了解磷脂過(guò)氧化的程度［10］。脂質(zhì)體被氧化程度越深，丙二醛含量越高，顏色越深，用紫外分光光度儀在532nm處測(cè)量出的吸光值也就越高。結(jié)果如圖9所示。

圖9 貯存時(shí)間與氧化程度的關(guān)系Fig.9 The relationship between storage time and the degree of oxidation

由圖9可知，隨著時(shí)間增加，吸光度逐漸增大，說(shuō)明脂質(zhì)體溶液中丙二醛的含量增多，脂質(zhì)體被氧化的程度更深。在10d內(nèi)，添加不同甾醇的脂質(zhì)體與空白脂質(zhì)體溶液的氧化程度都不大，這說(shuō)明脂質(zhì)體膜保持穩(wěn)定，10d后脂質(zhì)體的氧化程度加深，這是由于脂質(zhì)體膜是個(gè)不斷運(yùn)動(dòng)的平衡態(tài)膜，在貯藏過(guò)程中，膜上磷脂分子不停交換，導(dǎo)致脂質(zhì)體的聚集沉淀等，從而破壞脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加大豆植物甾醇和β－谷甾醇的脂質(zhì)體，穩(wěn)定性要高于加入豆甾醇和膽固醇的脂質(zhì)體。這是由于添加β－谷甾醇與大豆植物甾醇粒徑分布均勻，脂質(zhì)體溶液更加平衡穩(wěn)定。

2.3 膜微極性

芘是一種脂溶性探針，易分配于脂雙層中，在熒光光譜中，熒光強(qiáng)度I1(373nm)與I3(384nm)的比值大小取決于芘所處體系的極性，該值越大表明芘探針?biāo)幬h(huán)境的極性越大［11］。測(cè)定不同濃度的甾醇－脂質(zhì)體的熒光強(qiáng)度，微極性結(jié)果如圖10所示。

甾醇與膜結(jié)合時(shí)，3β－OH與水相結(jié)合，側(cè)鏈延伸到雙分子層的疏水核心與磷脂分子的脂肪鏈結(jié)合［12］。由圖10可知，加入甾醇，使得膜的微極性逐漸減小，且少量甾醇可較大程度的降低脂質(zhì)體的微極，說(shuō)明甾醇分子嵌入到磷脂雙分子層中時(shí)填充到了磷脂分子的間隙中，避免分子層外部的極性基團(tuán)影響分子層內(nèi)部的微極性。當(dāng)甾醇濃度高時(shí)，豆甾醇的微極性比其他甾醇的要大，可能是由于豆甾醇濃度大時(shí)容易形成甾醇的富集區(qū)，增大分子空隙，所以使得微極性較高。

圖10 不同甾醇與膜微極性關(guān)系Fig.10 Effects of different kind of sterol on membrane micro－polarity

2.4 膜流動(dòng)性

脂質(zhì)體的流動(dòng)性是脂質(zhì)體的一個(gè)重要物理性質(zhì)，膜的流動(dòng)性大，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性就小、藥物釋放快［13］。熒光探針DPH是一種疏水性極強(qiáng)的分子，在脂肪酸?；溨信帕休^好，常平行排列，更容易結(jié)合在雙分子層內(nèi)［14］。DPH在水中的熒光很小，可以忽略［15］，其熒光偏振度(P)結(jié)果反映了脂質(zhì)體烴區(qū)的平均活動(dòng)程度，熒光偏振度越小說(shuō)明磷脂膜的流動(dòng)性越大［16］。分別在25℃和55℃下測(cè)定甾醇－脂質(zhì)體的偏振度，結(jié)果如表1所示。

表1 不同甾醇－脂質(zhì)體在25和55℃時(shí)偏振度Table1 Different polarization degree of sterol－liposome at 25 and 55℃

由表1可知，空白脂質(zhì)體在55℃時(shí)的偏振度比在25℃時(shí)減小很多，這是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，磷脂分子疏水鏈會(huì)有全反式轉(zhuǎn)變?yōu)榕で鷳B(tài)，發(fā)生相變，會(huì)使得膜分子間距增大，流動(dòng)性降低。與空白脂質(zhì)體相比，在25℃時(shí)，甾醇－脂質(zhì)體偏振度更小，即流動(dòng)性更大;55℃時(shí)，甾醇－脂質(zhì)體的偏振度更大，即流動(dòng)性較小，說(shuō)明這幾種甾醇對(duì)脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性都有一定的調(diào)節(jié)作用。但是，不同甾醇對(duì)膜流動(dòng)性的調(diào)節(jié)作用大小不同，膽固醇＞大豆植物甾醇＞β－谷甾醇＞豆甾醇，這是由于膽固醇分子在相變溫度以上時(shí)，膽固醇、β－谷甾醇彎曲的?；滄溈筛玫奶畛湓诹字肿又?，通過(guò)范德華作用，限制磷脂脂肪酸鏈的運(yùn)動(dòng)。豆甾醇側(cè)鏈在C22和C23之間存在的雙鍵不彎曲，流動(dòng)性較強(qiáng)，在使得豆甾醇對(duì)膜流動(dòng)性的調(diào)劑作用相對(duì)較小。

3 結(jié)論

植物甾醇對(duì)磷脂脂質(zhì)體膜性質(zhì)的影響與膽固醇類(lèi)似，雖然膽固醇對(duì)脂質(zhì)體膜流動(dòng)性調(diào)節(jié)作用較強(qiáng)，但是β－谷甾醇，大豆植物甾醇調(diào)節(jié)的脂質(zhì)體在粒徑分布及穩(wěn)定性方面更優(yōu)，而且膜內(nèi)部的微極性小，分子結(jié)合更緊密，可以有效的降低膜的滲透率。豆甾醇對(duì)膜性質(zhì)的影響較小，但是可以跟谷甾醇，菜籽甾醇等發(fā)揮協(xié)同作用改善膜性質(zhì)，并可以降低膽固醇的危害。因此用β－谷甾醇，大豆植物甾醇替代膽固醇，既生產(chǎn)更加穩(wěn)定的脂質(zhì)體，又有益于人體健康。

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