張建榮，孫振學(xué)，邵素榮，耿燕秋

繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥(secondary hyperparathyroidism，SHPT，簡稱甲旁亢)是慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF )常見并發(fā)癥，磷潴留、低鈣及活性維生素D 缺乏已經(jīng)是公認(rèn)的參與SHPT 發(fā)生的重要因素［1－3］。此外很多文獻(xiàn)報道，一種新型的調(diào)磷因子成纖維細(xì)胞生長因子23(fibroblast growth factor－23，F(xiàn)GF23)在CRF 患者活性維生素D水平下降伴隨甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)分泌過多的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［4－6］。筆者通過免疫組化檢測甲旁亢患者甲狀旁腺組織中FGFR1 和Klotho 的表達(dá)水平，探討其在SHPT 發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象 武警總醫(yī)院腎內(nèi)科行甲狀旁腺切除術(shù)的SHPT 患者30 例(SHPT 組)，無腎臟病史的無償器官捐獻(xiàn)者6 例(健康組)。入選標(biāo)準(zhǔn):PTH ＞800 pg/ml、B 超檢查發(fā)現(xiàn)至少一個甲狀旁腺增生大于0.5 cm。排除標(biāo)準(zhǔn):明顯感染、惡性腫瘤、骨骼相關(guān)疾病、3 個月內(nèi)服用過維生素D 相關(guān)制劑及不愿參加者。SHPT 組與健康組的受試者均于術(shù)前留取空腹靜脈血，留取血清置于－80 ℃冰箱保存，手術(shù)切除受試對象甲狀旁腺組織，固定于10%甲醛溶液中。

1.2 方法 ELISA 法檢測血清FGF－23 水平，化學(xué)免疫發(fā)光法檢測血清iPTH 水平(試劑來自北京奇松生物科技有限公司)。蘇木素伊紅染色(hematoxylin－eosin staining，HE)甲狀旁腺組織。免疫組化方法檢測甲狀旁腺組織中FGFR1、klotho 的表達(dá)(FGFR1 兔抗人多克隆抗體ab71928，1 ∶200 美國abcam 公司，Klotho 兔抗人多克隆抗體ab69208，1∶300美國abcam 公司)，應(yīng)用IPP 軟件計算FGFR1、Klotho 積分吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS12.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間均數(shù)資料的比較，方差齊時采用t 檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗，線性回歸分析比較不同因素之間的相關(guān)性，P ＜0.05 視為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試對象一般情況 兩組患者的性別、年齡和血鈣水平無顯著差異。甲旁亢組的血尿素肌酐、血磷、堿性磷酸酶、FGF－23 和PTH 水平均顯著高于健康組(表1)。

表1 受試對象一般情況 (±s)

表1 受試對象一般情況 (±s)

項目健康組SHPT 組P 27 ±548.70 ±9.28＞0.05性別(男/女)4/211/19＞0.05 Urea(mmol/L)3.63 ±0.8517.50 ±3.23＜0.05 Cr(umol/L)56.39 ±11.51 1831.34 ±725.67 ＜0.05 Ca(mmol/L)2.15 ±0.392.41 ±0.32＞0.05 P(mmol/L)0.98 ±0.121.8 ±0.41＜0.05 ALP(U/L)79 ±106252 ±131＜0.05 FGF－23(pg/ml) 32.70 ±10.27 926.60 ±373.68 ＜0.05 PTH(pg/ml)年齡(歲)38.00 ±8.64 2666.56 ±953.41 ＜0.05

2.2 甲狀旁腺組織普通病理 HE 染色顯示健康組的甲狀旁腺腺細(xì)胞排成索團(tuán)狀，主要包括主細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞兩種;主細(xì)胞數(shù)量最多，呈圓形或多邊形，核圓，位于細(xì)胞中央，HE 染色切片中胞質(zhì)著色淺;嗜酸性細(xì)胞比主細(xì)胞大，核較小，染色深。SHPT組的甲狀旁腺組織呈結(jié)節(jié)樣增生18 例，彌漫性增生12 例。增生的組織中正常結(jié)構(gòu)破壞，主細(xì)胞大量增生，失去原來的結(jié)構(gòu)(圖1)。

2.3 甲狀旁腺組織免疫組化 SHPT 組FGFR1、Klotho 的表達(dá)比健康組顯著下降，且在結(jié)節(jié)性增生組織中的表達(dá)顯著低于彌漫性增生組織(圖2，表2)。

圖1 健康組與SHPT 組的甲狀旁腺組織(HE 染色，×100)

圖2 FGFR1、Klotho 在健康組與SHPT 組甲狀旁腺組織的免疫組化表達(dá)(×400)

表2 健康組與SHPT 組FGFR1 與Klotho 的免疫組化表達(dá)情況 (±s)

表2 健康組與SHPT 組FGFR1 與Klotho 的免疫組化表達(dá)情況 (±s)

注:與健康組相比，①P ＜0.05;與彌漫性增生組相比，②P ＜0.05

分組FGFR1 積分吸光度Klotho 積分吸光度健康組(n=6)692.00 ±38.49 532.17 ±13.53彌漫性增生組(n=12) 326.48 ±65.93①253.12 ±46.23①結(jié)節(jié)性增生組(n=18) 176.25 ±75.33②101.07 ±73.88②

3 討論

FGF23 需要在Klotho 蛋白存在的情況下與FGFR1 結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用［7，8］。Klotho 是一種跨膜蛋白，它決定FGF23 的特異性。在正常的腎臟中，F(xiàn)GF23 在遠(yuǎn)端小管［9］與FGFR1－Klotho 復(fù)合體結(jié)合在腎臟近端小管抑制鈉轉(zhuǎn)運體和1α 羥化酶活性，從而增加磷的排泄和抑制活性維生素D 的活性［10，11］。對于腎臟病患者，為了維持體內(nèi)正常的血磷水平，F(xiàn)GF23 隨著腎臟病的進(jìn)展逐漸升高，進(jìn)而進(jìn)一步抑制活性維生素D 的水平，從而加速SHPT 的進(jìn)展。更重要的是甲狀旁腺組織也是FGF23 的靶器官，F(xiàn)GFR1 和Klotho 表達(dá)于甲狀旁腺組織中［12，13］。很多研究已表明FGF23 可在Klotho 存在時與FGFR1 結(jié)合通過促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑發(fā)揮降低PTH 的作用。所以慢性腎衰時FGF23 可直接或間接加速SHPT 的進(jìn)展。

FGF－23 是近年發(fā)現(xiàn)的主要由成骨細(xì)胞產(chǎn)生的新型的調(diào)磷因子。Hirotaka 等［14］報道稱，生理狀態(tài)下FGF－23 在Klotho 存在的情況下在甲狀旁腺組織與FGFR1 結(jié)合發(fā)揮降低PTH 表達(dá)的作用。而在CRF 合并SHPT 時，盡管FGF－23 水平很高而PTH 水平卻未下降，對于SHPT 時甲狀旁腺細(xì)胞對FGF－23 產(chǎn)生的抵抗性可能性機(jī)制是本研究的主要目的。

本研究主要從FGFR1 和Klotho 在SHPT 患者甲狀旁腺組織表達(dá)水平變化方面初步的探討SHPT發(fā)生機(jī)制。Rocio Canalejo 等［15］報道稱，在正常狀態(tài)下，F(xiàn)GF－23 可在Klotho 存在的情況下通過MAPK 直接作用于甲狀旁腺組織降低PTH 的分泌，增加甲狀旁腺組織中鈣受體(calcium sensing receptor，CaR)、維生素D 受體(Vitamin D receptor，VDR)的表達(dá)，降低甲狀旁腺細(xì)胞的增殖，而且誘導(dǎo)調(diào)節(jié)FGF－23 的胞外信號調(diào)節(jié)激酶的磷酸化(ERK1/2)。而對SHPT 患者，F(xiàn)GF－23 則不能發(fā)揮下調(diào)PTH 的分泌的作用，VDR 和CaR 的表達(dá)也未得到提升，同時沒有激活ERK1/2 的信號途徑。此理論在一定程度上說明，F(xiàn)GFR1、Klotho 水平變化在FGF23 發(fā)揮降低PTH 作用方面起到關(guān)鍵作用。

本研究通過檢測受試對象血清FGF－23 與PTH 水平，發(fā)現(xiàn)FGF－23 和PTH 水平明顯高于健康組，在一定程度上說明慢性腎衰竭繼發(fā)性甲旁亢患者甲狀旁腺細(xì)胞對FGF－23 存在抵抗性，說明甲狀旁腺細(xì)胞對FGF－23 抑制作用的敏感性降低，其中的機(jī)制目前尚不清楚，筆者試圖通過免疫組化從蛋白水平初步地分析其機(jī)制。

本研究免疫組化分析顯示，CRF 合并SHPT 患者甲狀旁腺組織中FGFR1、Klotho 的表達(dá)與健康組甲狀旁腺組織的表達(dá)相比明顯下調(diào)，尤其在結(jié)節(jié)性增生組織中比彌漫性增生組織中表現(xiàn)得更明顯，此結(jié)果對探討SHPT 發(fā)生機(jī)制有一定的意義。FGFR1、Klotho 表達(dá)降低，導(dǎo)致FGF－23 通過MAPK 通路直接作用于甲狀旁腺使之降低PTH 的作用受阻，反饋刺激產(chǎn)生更高水平的FGF－23 來代償維持機(jī)體的平衡，最終導(dǎo)致FGF－23 與PTH 的相互調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂，機(jī)體保持高水平的FGF－23 和SHPT 狀態(tài)，進(jìn)一步促進(jìn)了SHPT 的發(fā)生發(fā)展。

總之，Klotho、FGFR1 在慢性腎衰竭繼發(fā)性甲旁亢的甲狀旁腺組織中表達(dá)明顯下調(diào)，表明Klotho－FGFR1 復(fù)合體的降低在一定程度上可解釋甲狀旁腺細(xì)胞對FGF－23 的抵抗性。FGF－23－klotho－FGFR1 系統(tǒng)在SHPT 的發(fā)病機(jī)制起著重要作用。

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