李佩瓊劉翠嫻林俊偉田琪章鈞★

?論 著?

一例無癥狀8號(hào)三體的遺傳學(xué)構(gòu)成初探

李佩瓊1劉翠嫻1林俊偉2田琪2章鈞2★

目的針對(duì)一例無癥狀的8號(hào)染色體三體的患者，研究其8號(hào)染色體的來源機(jī)制和作用機(jī)制。方法利用患者外周血進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及G顯帶技術(shù)分析，以確定淋巴細(xì)胞核型；利用患者外周血總DNA進(jìn)行SNP微陣列技術(shù)分析，以確定各類有核細(xì)胞的分子核型。結(jié)果患者外周血淋巴細(xì)胞核型為47，XX，+8；患者外周血各種有核細(xì)胞總DNA基因型為47，XX，+8。結(jié)論確診患者外周血有核細(xì)胞的核型均為47，XX，+8，并且多出來的那條染色體可能由于第二次減數(shù)分裂不分離而導(dǎo)致的，尚不能明確該患者沒有明顯臨床癥狀的機(jī)制。

8號(hào)染色體三體；核型分析；SNP微陣列技術(shù)分析

在新生活嬰中，染色體異常的發(fā)生率為0.7%，在自發(fā)流產(chǎn)胎兒中約有50%是由染色體畸變所致，其中大部分是染色體數(shù)目異常。只有小于10%的原因是結(jié)構(gòu)異?；蛘咂渌漠惓C(jī)制[1]。非整倍體疾病以三體型和單體型常見，95% 以上的三體綜合征在出生前流產(chǎn)[2]?；町a(chǎn)兒中最常見的三體綜合征包括21-三體綜合征（Down Syndrome）、18-三體綜合征（Edwards Syndrome）、13-三體綜合征（Patau Syndrome）、Kline fi lter 綜合征, 單體綜合征以Turner綜合征最為常見[3]。

人類的8號(hào)染色體是23對(duì)染色體之一，正常狀況下每個(gè)細(xì)胞擁有兩條。此染色體含有大約155百萬個(gè)堿基對(duì)，占細(xì)胞內(nèi)所有DNA的4.5%～5%。該染色體有兩條臂。其中較短的8p臂有大約4 500萬個(gè)堿基對(duì)，有基因484個(gè)，假基因110個(gè)，約占總基因組數(shù)量的1.5%。這其中8%的基因和神經(jīng)發(fā)育及功能有關(guān)，16%的基因和癌癥有關(guān)。8號(hào)染色體異常常見的臨床表現(xiàn)：智力缺陷，協(xié)調(diào)性差；面貌上特點(diǎn)有前額突出，眼窩深陷，斜視，眼間距寬，鼻根寬且鼻孔突出，耳輪厚等特點(diǎn)；此外，骨骼，腎臟，心臟亦有異常。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，8號(hào)染色體三體是血液病中最常見的染色體數(shù)目異常，廣泛存在于惡性血液病, 尤其多見于MDS、AML、CML、骨髓增殖性疾病（MPD）等髓系疾病, 在AML、MDS、MPD 中的發(fā)生率分別為5.6%、7.5%、7.5%, 較少見于淋巴細(xì)胞性疾病，因此8號(hào)染色體三體可能在惡性血液病尤其是髓系疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[4,5]。

本研究是圍繞一名女患者展開的，該患者外周血核型為47，XX，+8，有流產(chǎn)史，無明顯的臨床癥狀。針對(duì)這一罕見的染色體數(shù)目異常病例，本課題將利用細(xì)胞以及分子遺傳學(xué)來研究其發(fā)生的機(jī)制，探究患者無明顯臨床癥狀的原因。

1 材料與方法

1.1 研究材料

患者女性，35歲，有三次流產(chǎn)史，無其他明顯臨床癥狀。取其外周血做以下檢測：一種是外周血培養(yǎng)，做核型分析；另外一種是提取患者外周血的DNA，做基因芯片檢測。

1.2 外周血染色體制片

取血→接種→37℃培養(yǎng)68～72 min→提前1.5～2 min加入秋水仙素→1 800 rpm離心5 min，收集細(xì)胞→棄上清，加8 mL低滲液反復(fù)沖打，37℃低滲25 min→加1 mL固定液，預(yù)固定5 min→1 800 rpm離心8 min→棄上清，加入8 mL固定液固定45 min，反復(fù)固定兩次→滴片→烤片→G顯帶→染色→吹干→鏡檢。

1.3 基因芯片檢測

使用Qiagen DNA mini kit提取外周血DNA，取20μL DNA交由上海尤尼曼公司做基因芯片檢測。剩下的DNA樣品放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 外周血核型分析結(jié)果顯示患者的淋巴細(xì)胞核型為47，XX，+8（見圖1）。

2.2 患者外周血總DNA SNP微陣列技術(shù)顯示患者外周血8號(hào)染色體SNP基因型為AAA、AAB、ABB、BBB，顯示患者為純合的8號(hào)染色體三體，而且其基因型比例為AAA∶（AAB+ABB）∶BBB等于1∶1∶1（見圖2）。

圖1 核型分析Figure 1 Karyotype analysis

圖2 基因芯片F(xiàn)igure 2 SNP microarray analysis of trisomy 8

3 討論

3.1 核型結(jié)果、基因芯片結(jié)果分析

染色體核型分析是診斷非整倍體疾病的金標(biāo)準(zhǔn),它能提供準(zhǔn)確、豐富的信息量[6]。但國外曾有報(bào)道8號(hào)染色體三體異常細(xì)胞在懷孕的嵌合體羊水細(xì)胞培養(yǎng)后消失[7]。而且，外周血染色體核型分析主要針對(duì)淋巴細(xì)胞，對(duì)于其他單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞都沒有檢查到。所以本實(shí)驗(yàn)又增加了基因芯片檢測，這樣就能準(zhǔn)確分析診斷出患者外周血是否全部有核細(xì)胞都是純合的8號(hào)染色體三體?；蛐酒瑱z測具有準(zhǔn)確性高、高通量、判讀方便等特點(diǎn)，適合于本病例的檢測[8]。

外周血核型分析結(jié)果顯示患者的淋巴細(xì)胞核型為47，XX，+8?；颊咄庵苎侱NA SNP微陣列技術(shù)顯示患者外周血8號(hào)染色體SNP基因型為AAA、AAB、ABB、BBB，顯示患者為純合的三體，而且其基因型比例為AAA∶（AAB+ABB）∶BBB等于1∶1∶1，與核型正常的人SNP基因型比例AA∶AB∶BB等于1∶1∶1的結(jié)果一致。根據(jù)芯片的結(jié)果，我們推測該患者染色體數(shù)目異常可能是早期受精卵有絲分裂異?；蚋改钙渲幸环缴臣?xì)胞第二次減數(shù)分裂異常導(dǎo)致的（見圖2）。迄今為止, 除17號(hào)染色體尚未發(fā)現(xiàn)三體外, 其余各染色體都已發(fā)現(xiàn)有三體型病例。這暗示所有染色體都可能出現(xiàn)不分離的傾向。然而, 臨床較常見的是13、18、21 三體及性染色體數(shù)目異常,其它染色體的非整倍體卻非常罕見[9]。所以，患者屬于染色體數(shù)目異常人群，這可能也就是造成患者流產(chǎn)的原因。因?yàn)槟壳捌毡檎J(rèn)為遺傳因素是造成自然流產(chǎn)的首要原因，遺傳因素中就包括胚胎的染色體異常，染色體異常的類型包括染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)異常兩種。在自然流產(chǎn)胚胎中染色體異常的表現(xiàn)形式為主要染色體數(shù)目異常。這是因?yàn)槌Ｈ旧w數(shù)目異常遺傳缺陷大、致死性高，容易造成胚胎死亡或停止發(fā)育[10,11]。

3.2 本研究的不足和展望

本研究沒有取到研究對(duì)象更多的其他組織做嵌合體檢查。由于研究對(duì)象是自己一個(gè)人前來看病，沒能取到其父母的外周血，所以沒能利用單核苷酸多態(tài)性來檢測其外周血多出來的那條8號(hào)染色體是來自父方還是來自母方。查找文獻(xiàn)，下一步研究擬利用印記基因來檢測其額外的8號(hào)染色體的來源，通過亞硫酸氫鹽基因測序的方法來檢測。但是，就目前的8號(hào)染色體上印記基因的研究報(bào)道已確認(rèn)的有KCNK9、DLGAP2，但這兩個(gè)印記基因的確定是利用單核苷酸多態(tài)性來確認(rèn)的[12]，所以尚不知道這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)是否受甲基化調(diào)控。下一步研究計(jì)劃可以先確定8號(hào)染色體上印記基因的CpG島的甲基化差異位點(diǎn)，然后再繼續(xù)進(jìn)一步的研究。

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The exploratory study on the genetic constitution of a case of trisomy 8 without obvious clinical symptom

LI Peiqiong1, LIU Cuixian1, LIN Junwei2, TIAN Qi2, ZHANG Jun2★
(1.Department of Cell Biology and Genetics, School of Basic Science, Guangzhou Medical University, Guangdong, Guangzhou 510182, China; 2.Department of the Maternity, The Third Af fi liated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangdong, Guangzhou 510630, China)

ObjectiveTo explore the mechanisms of the patient with trisomy 8 in peripheral blood who had no obvious clinical symptom.MethodsThe lymphocyte karyotype was determined by lymphocyte culture and G-banding technique with patient's peripheral blood. Total DNA from patient's peripheral blood were analysed by SNP microarray to determine the molecular karyotype of all kinds of nucleated cells.ResultsThe lymphocyte karyotype of patient's peripheral blood was 47, XX, +8. Total DNA genotype of nucleated cells from patient's peripheral blood was 47, XX, +8.ConclusionThe karyotype of nucleated cells from patient's peripheral blood was 47, XX, +8, and the extra chromosome existence may be due to the chromosome without separation in the second meiotic division. It is unclear that the mechanism of patient without obvious clinical symptom.

Trisomy 8; Karyotyping; SNP microarray technology

國家自然科學(xué)基金（81102715）；廣東省科技廳承擔(dān)政府特定任務(wù)項(xiàng)目（2011B061200045）

1.廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣東，廣州 510182

2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室，廣東，廣州 510630

★通訊作者: 章鈞，E-mail:16879288@qq.com