李群珍鄧紅何勁松伍茵張茂祥藍偉紅

?論 著?

二十二碳六烯酸聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人肝癌細胞HepG2耐藥相關蛋白表達的影響

李群珍1鄧紅2★何勁松1伍茵1張茂祥1藍偉紅1

目的研究二十二碳六烯酸（DHA）聯(lián)合5氟尿嘧啶（5-FU）對人肝癌細胞HepG2耐藥相關蛋白ERK、JNK及p38的表達。方法Western blot檢測5-FU 5μg/mL，或5-FU 5μg/mL聯(lián)合DHA 30 μg/mL作用HepG2細胞48 h后ERK、JNK及p38蛋白表達。結果與單用5-FU組比較，5-FU聯(lián)合DHA組對耐藥相關蛋白的影響，p-ERK明顯受到抑制，而p-JNK表達顯著增加，p-p38表達無差別。結論DHA對肝癌細胞耐藥相關蛋白的調控可能通過抑制ERK、激活JNK信號通路來增強5-FU的細胞毒活動，發(fā)揮增敏化療藥物的作用。

二十二碳六烯酸；5-氟尿嘧啶；肝癌；多藥耐藥；絲裂原活化蛋白激酶

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是人體必需脂肪酸，主要從深海魚油中獲得[1]。近年來多項流行病學及基礎研究發(fā)現(xiàn)，DHA不僅對多種惡性腫瘤具有抑制作用，而且能夠增強化療藥物5-氟尿嘧啶（5- fl uorouracil，5-FU）的療效[2]。但近年來，傳統(tǒng)化療藥物的長期應用使癌細胞耐藥現(xiàn)象越來越普遍，這大大影響了化療藥物的臨床應用。因此，研究腫瘤細胞對5-FU的耐藥機制、增加腫瘤細胞對5-FU的敏感性迫在眉睫。本研究以肝癌細胞株HepG2為主要對象,比較單用5-FU與5-FU聯(lián)合DHA對耐藥相關蛋白的表達。

1 材料與方法

1.1 肝癌細胞株

肝癌細胞HepG2來源于ATCC，購自中國科學院細胞庫，來源于一個15歲白人的肝癌組織。該細胞分泌多種血漿蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細胞能大容量培養(yǎng)，乙肝表面抗原陰性，對G418有抗性，對人生長激素有刺激反應。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

HepG2細胞是人肝癌細胞株，含青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、0.3 g/L L-甘氨酸、0.85 g/L NaHCO3、10%小牛血清（56℃，滅活30 min）的DMEM完全培養(yǎng)液，在100%濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃單層貼壁生長，待長至80～90%融合時，用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)，每2～3天換液一次，每5 天傳代一次，收集指數(shù)期細胞進行實驗。

二十二碳六烯酸（cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，SIGMA，USA）（St. Louis, MO），純度≥98%，融于無水酒精，濃度20 mg/mL，充滿氮氣后-80℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

5-氟尿嘧啶（SIGMA，USA），融于二甲基亞砜DMSO（SIGMA，USA），濃度32 mg/mL，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

Western Blot檢測MAPK蛋白表達變化：提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，配制10%蛋白電泳分離膠和5%積層膠，蛋白變性上樣，上樣量30μg，按照積層膠電壓 70 V，分離膠電壓 100 V電泳，待溴酚藍指示劑遷移到凝膠底部時停止電泳。恒壓20 V，30 min半干電轉膜，5%的脫脂奶粉/TBS-T室溫封閉1 h，5%的脫脂奶粉/TBS-T 1:500稀釋相應的一抗，與PVDF膜4℃孵育過夜，TBS-T洗滌，同樣方法1:3000稀釋HRP標記二抗，室溫1 h，TBS-T洗滌后，ECL化學發(fā)光法檢測，Quantity one（Bio-Rad）軟件半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

各組藥物干預后對ERK、JNK及p38蛋白表達的影響：利用Western Blot檢測5-FU 5 μg/mL，或5-FU 5 μg/mL聯(lián)合DHA 30 μg/mL作用HepG2細胞48 h后ERK、JNK及p38蛋白表達。結果顯示，與對照組比較，5-FU單獨處理組HepG2細胞的p-ERK表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），p-JNK表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而p-p38表達無變化（P＞0.05）。

5-FU聯(lián)合DHA組與單用5-FU組比較，聯(lián)合組p-ERK較單用5-FU組表達明顯受到抑制（P＜0.01），而p-JNK表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），p-p38表達無差別（P＞0.05）（見圖1和表1）。

3 討論

肝癌目前仍是我國發(fā)病率居前列的腫瘤，雖然肝癌綜合治療方面已做了大量研究并取得了一定的效果，但肝癌術后5年總生存率仍不夠理想?；熓侵委煾伟┍夭豢缮俚氖侄沃?，但有很大部分患者對化療藥物產(chǎn)生耐藥使得腫瘤細胞對化療藥物不敏感。單藥治療效果不佳，多藥聯(lián)合化療可減少腫瘤的耐藥性，提高治療效果。

最近研究表明DHA不僅本身具有抗癌作用，DHA和某些藥物有協(xié)同作用，可增強抗癌藥物的細胞毒性，提升腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，減少抗癌藥物的副作用。腫瘤化療藥物耐藥性的存在，尤其是多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象，嚴重阻礙了化療藥物的應用[3]。目前大多數(shù)研究都認為，ERK的過度激活與多種化療藥物的耐藥性存在明顯正相關，其作用機制可能是通過調控耐藥相關基因和蛋白的表達[4]。Weldon等[5]通過基因芯片技術對MCF7細胞株1 186個基因進行分析后發(fā)現(xiàn)，MEK5（ERK5上游激酶）的過表達與耐藥株APOMCF7的耐藥性存在明顯的相關性。Kisucká等[6]發(fā)現(xiàn)，鼠白血病細胞系的耐藥株L1210/VCR（長春新堿）多藥耐藥與ERK持續(xù)激活相關，其機制可能是ERK激活引起腫瘤細胞表面多藥轉運蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）基因表達量增加，P-gp可將藥物從細胞內泵出，使細胞內VCR濃度降低從而產(chǎn)生耐藥，而MEK特異性抑制劑PD98059和U0126可以抑制ERK活性，從而提高細胞內VCR濃度并且逆轉L1210/VCR的耐藥性。

表1 ERK、JNK、p38在不同處理組細胞中的表達水平（相對于內參GAPDH的條帶灰度值）Table 1 Expression level of JNK, ERK, and p38 in different groups（data of relative density compared with GAPDH）

圖1 5-FU單用或聯(lián)合DHA對HepG2細胞JNK、ERK及p38蛋白表達的影響Figure 1 Expression of JNK, ERK and p38 in HepG2 treated with 5-FU or 5-FU in combination with DHA for 48 hours

MDR癌細胞的存在是肝癌化療失敗的根本原因，因此，如何較滿意地解決肝癌細胞MDR問題已成為當務之急[7]。有資料表明，通過調節(jié)腫瘤細胞絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）系統(tǒng)的表達有可能逆轉MDR，成為腫瘤治療的新方法[8]。Chen等[9]發(fā)現(xiàn)胃癌細胞株MGC803預先用VCR處理72 h后，細胞內P-gp表達量增加，對VCR的耐藥性提高了2.24倍，加入PD98059可以抑制P-gp表達，并且逆轉MGC803對VCR的耐藥性。但是，對于JNK和p38的激活程度在腫瘤化療藥物的作用目前還存在很多爭議。一些研究發(fā)現(xiàn)，JNK和p38激活程度與腫瘤化療的敏感性存在正相關。如Mansouri等[10]比較了卵巢癌順鉑（CDDP）敏感株2008以及耐藥株2008C13中MAPK激活情況，發(fā)現(xiàn)敏感株JNK和p38的激活程度明顯超過耐藥株。然而，另一些研究卻發(fā)現(xiàn)JNK和p38的持續(xù)激活與腫瘤細胞的耐藥性正相關[11]。

為了研究DHA是否可通過增強5-FU細胞毒性的調控機制，我們研究了DHA聯(lián)合5-FU對MAPK信號通路的影響，Western Blot檢測證實DHA聯(lián)合5-FU較單獨使用5-FU組，ERK被抑制更加明顯，JNK被激活更加顯著，而p38活性沒有變化。這提示DHA可能通過抑制ERK或激活JNK活性，從而增強5-FU的細胞毒活性。

因此，在研究DHA聯(lián)合5-FU誘導肝癌細胞凋亡的分子機制時，采用Western Blot方法檢測5-FU單用或聯(lián)合DHA對HepG2細胞MAPK蛋白表達的變化，初步揭示DHA還可通過抑制ERK或激活JNK信號通路來增強5-FU的細胞毒活性。期望利用DHA通過不同通路協(xié)同化療藥物誘導細胞凋亡的特點，同時可靶向耐藥位點達到逆轉耐藥目的，拓展肝癌治療領域的研究，但是否能應用于臨床尚需在動物實驗和臨床試驗來進一步驗證。

[1] 張徐寧, 戴翠萍. 二十二碳六烯酸抗癌作用的研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2010, 6(6): 165-168.

[2] Terry P, Wolk A, Vainio H, et al. Fatty fish consumption lowers the risk of endometrial cancer: a nationwide casecontrol study in Sweden[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2002, 11(1): 143-145.

[3] Stein W D, Bates S E, Fojo T. Intractable cancers: the many faces of multidrug resistance and the many targets it presents for therapeutic attack[J]. Curr Drug Targets, 2004, 5(4): 333-346.

[4] Fujita T, Washio K, Takabatake D, et al. Proteasome inhibitors can alter the signaling pathways and attenuate the P-glycoprotein-mediated multidrug resistance[J]. Int J Cancer, 2005, 117(4): 670-682.

[5] Weldon C B, Scandurro A B, Rolfe K W, et al. Identification of mitogen-activated protein kinase kinase as a chemoresistant pathway in MCF-7 cells by using gene expression microarray[J]. Surgery, 2002, 132(2): 293-301.

[6] Kisucká J, Barancík M, Bohácová V, et al. Reversal effect of specific inhibitors of extracellular-signal regulated protein kinase pathway on P-glycoprotein mediated vincristine resistance of L1210 cells[J]. Gen Physiol Biophys, 2001, 20(4): 439-444.

[7] Lasagna N, Fantappiè O, Solazzo M, et al. Hepatocyte growth factor and inducible nitric oxide synthase are involved in multidrug resistance-induced angiogenesis in hepatocellular carcinoma cell lines[J]. Cancer Res, 2006, 66(5): 2673-2682.

[8] Kohno M, Pouyssegur J. Targeting the ERK signaling pathway in cancer therapy[J]. Ann Med, 2006, 38(3): 200-211.

[9] Chen B, Jin F, Lu P, et al. Effect of mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway on multidrug resistance induced by vincristine in gastric cancer cell line MGC803[J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(6): 795-799.

[10] Mansouri A, Ridgway L D, Korapati A L, et al. Sustained activation of JNK/p38 MAPK pathways in response to cisplatin leads to Fas ligand induction and cell death in ovarian carcinoma cells[J]. J Biol Chem, 2003, 278(21): 19245-19256.

[11] Zhao Y, You H, Yang Y, et al. Distinctive regulation and function of PI 3K/Akt and MAPKs in doxorubicin-induced apoptosis of human lung adenocarcinoma cells[J]. J Cell Biochem, 2004, 91(3): 621-632.

Effect of docosahexaenoic acid plus 5-fluorouracil on the drug-resistance associatedprotein of HepG2

LI Qunzhen1, DENG Hong2★, HE Jingsong1, WU Yin1, ZHANG Maoxiang1, LAN Weihong1
(1.Department of Nutrition, Second Hospital of Shenzhen, Guangdong, Shenzhen 518035, China; 2.Food and Nutrition Department, Public Health and Tropical Medicine of the Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

ObjectiveTo study the expression of drug-resistance associated protein, such as ERK, JUK and P38, in hepatocellular carcinoma HepG2 cells treated with docosahexaenoic acid and 5- fl uorouracil.MethodsThe expression of JNK, ERK and p38 were analyzed in HepG2 treated with 5-FU or 5-FU in combination with DHA for 48 hours by western blot.ResultsWhen compared with the group only treated with 5-FU, samples from the group treated with 5-FU and DHA showed different expression level of drugresistance associated-proteins. Down regulation of p-ERK, up regulation of p-JNK and no change of p-p38 could be found in the latter group.ConclusionWith inhibiting the p-ERK and activating p-JNK, DHA could regulate hepatocellular carcinoma cells to signi fi cantly enhance the cytotoxic activity of 5-FU. So that it could play a role in the sensitization of chemotherapy drugs.

Docosahexaenoic acid (DHA); 5- fl uorouracil (5-FU); Primary liver cancer; Multidrug resistance (MDR); Mitogen-activated protein kinase (MAPK)

1.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院營養(yǎng)科，廣東，深圳 518035

2.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學院營養(yǎng)與衛(wèi)生學系，廣東，廣州 510515

★通訊作者：鄧紅，E-mail: hongd@ fi mmu.com