張如華 胡開順 武遠(yuǎn)眾 康鐵邦

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BRD7逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定系的構(gòu)建及其功能評(píng)價(jià)

張如華 胡開順 武遠(yuǎn)眾 康鐵邦★

目的探索BRD7（bromodomain-containing protein 7）是否具有抑癌基因的功能。方法根據(jù)NCBI提供的BRD7基因序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增其編碼區(qū)序列，經(jīng)酶切、連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)一步挑取單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR篩選及測(cè)序鑒定得到陽(yáng)性重組質(zhì)粒。共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞后收集濃縮病毒上清并感染U2OS細(xì)胞，24 h后用嘌呤霉素（puromycin）篩選穩(wěn)定表達(dá)BRD7的細(xì)胞株。結(jié)果菌落PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序分析證明重組pMSCV-BRD7-GFP質(zhì)?？寺〕晒ΑFP綠色熒光結(jié)果顯示，絕大部分細(xì)胞成功整合了pMSCV-GFP或pMSCV-BRD7-GFP外源質(zhì)粒；Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)感染重組質(zhì)粒pMSCVBRD7-GFP的細(xì)胞株中BRD7蛋白的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。功能結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)BRD7顯著抑制U2OS細(xì)胞的增殖，促進(jìn)下游靶基因p21與MDM2的表達(dá)。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了針對(duì)BRD7基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定系，且初步證明了BRD7發(fā)揮抑癌基因的功能，為下一步深入研究其被調(diào)控的機(jī)制與功能奠定了基礎(chǔ)。

BRD7；病毒載體；穩(wěn)定株；抑癌基因

Bromodomain蛋白是一類進(jìn)化上高度保守的由110個(gè)氨基酸組成的蛋白元件，對(duì)乙?；馁嚢彼峋哂懈叨鹊挠H和性。這種蛋白多數(shù)存在于染色質(zhì)相關(guān)蛋白，其名字來(lái)源于在果蠅中首先被鑒定的同源蛋白Brahma[1]。因這種Bromodomain結(jié)構(gòu)域能夠與特異的乙?；嚢彼峤Y(jié)合，提示了其可能參與了一些蛋白-蛋白之間的相互作用，特別存在于染色質(zhì)重建及轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程中[2,3]。組蛋白的乙酰化作為控制開關(guān)參與了染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄的激活與抑制，乙?；ㄟ^(guò)中和組蛋白的正電荷減弱了與DNA的相互作用，從而使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，增加了轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[4]。含Bromodomain結(jié)構(gòu)域的蛋白常常通過(guò)HATs、HDACs與其它一些染色質(zhì)重建蛋白（Swi2/Snf2，SWI/SNF復(fù)合物亞基 ATPase）發(fā)揮一系列的染色質(zhì)修飾作用[5,6]。

BRD7作為一個(gè)75 kDa，從低等的果蠅到高等的人類均具有一個(gè)保守的bromodomain結(jié)構(gòu)域，與人類鋅指蛋白Peregrin、BR140具有最大的相似性，高表達(dá)于睪丸精原細(xì)胞[7]。BRD7包含一個(gè)Bromodomain，提示其在染色質(zhì)重建及轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。而且BRD7與超乙?；慕M蛋白H3和H4共定位，與乙?；疞ys14的H3緊密結(jié)合而與非乙?；幕蛞阴；疞ys9結(jié)合松散[8,9]。BRD7也與激活的DNA聚合酶Ⅱ共定位而不是SWI/SNF染色質(zhì)重建復(fù)合物的成分BRG1[9]。BRD7不具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，其過(guò)表達(dá)并不能增加組蛋白的乙酰化進(jìn)而不能大范圍地參與染色體的重建過(guò)程[10]。對(duì)于BRD7在細(xì)胞周期的功能及作用機(jī)制目前報(bào)道很少。在本研究中，擬選用骨肉瘤細(xì)胞系U2OS構(gòu)建BRD7高表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-BRD7-GFP，并構(gòu)建能穩(wěn)定高表達(dá)BRD7的細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究BRD7在細(xì)胞周期中被調(diào)控的機(jī)制與功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

U2OS和HEK293T細(xì)胞由中山大學(xué)腫瘤防治中心保存。pMSCV-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（含有嘌呤霉素抗性基因）及病毒包裝質(zhì)粒E vector、G vector為中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院尹東教授饋贈(zèng)。BglⅡ、Xho I 內(nèi)切酶以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均為Fermentas公司產(chǎn)品, 高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase與T4 DNA Ligase購(gòu)自Takara公司，質(zhì)粒小提試劑盒和切膠回收試劑盒均購(gòu)自Qiagen公司。Trizol試劑和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。兔抗人BRD7多克隆抗體為Bethyl公司產(chǎn)品, 鼠抗人GAPDH 抗體購(gòu)自Santa Curz 公司，感受態(tài)細(xì)胞DH5α以及HRP羊抗兔和鼠二抗均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。PEG-8000、Polybrene和puromycin均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 293T細(xì)胞總RNA 的提取

按照Trizol 試劑說(shuō)明書步驟提取總RNA。收集所培養(yǎng)的U2OS細(xì)胞，6孔板中每孔加入1 mL Trizol試劑，冰上靜置5 min。加入氯仿0.2 mL，充分混勻，冰上靜置2～3 min 后，4℃12 000 g離心15 min。將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的無(wú)RNA酶的EP管中，加入500μL的異丙醇，充分混勻，冰上靜置10 min。4℃，12 000 g離心10 min。棄上清，加入75%乙醇1 mL，4℃7 500 g/min 離心5 min。棄上清，室溫干燥5～10 min，加入40 μL DEPC 處理水，所得的RNA保存于- 80℃。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank的基因序列（NM_001173984），設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增BRD7編碼區(qū)。上、下游引物中分別引入BglⅡ、XhoI酶切位點(diǎn),同時(shí)在N端加入Flag標(biāo)簽肽段。所有引物均由Invitrogen公司合成。引物序列見表1。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

RNA用分光光度計(jì)測(cè)濃度后行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，選用MBI Fermentas 公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit按試劑說(shuō)明書操作。合成的cDNA置于-20℃保存。 取1.5 μL cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min； 94℃變性30 s，60℃退火30 s， 72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)。再于72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后切膠回收。膠回收根據(jù)Qiagen公司的膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

表1 引物序列Table 1 Primer Sequence

1.2.4 pMSCV-BRD7-GFP重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建

1.2.4.1 目的基因片段和載體雙酶切

用BglⅡ、XhoI酶分別雙酶切回收的BRD7目的片段以及載體pMSCV-GFP，37℃酶切30 min。

1.2.4.2 切膠回收

雙酶切后的產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，按試劑說(shuō)明書操作。

1.2.4.3 目的片段與pMSCV-GFP表達(dá)載體的連接

將回收的目的基因BRD7片段以及載體pMSCV-GFP在T4 DNA 連接酶作用下連接，16℃水浴反應(yīng)過(guò)夜。

1.2.4.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

各取5μL過(guò)夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，分別涂布于含氨芐抗性的LB 平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。從每個(gè)培養(yǎng)皿上各挑取3個(gè)單克隆菌落接種于6 mL含氨芐抗性的LB 培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.4.5 質(zhì)粒提取與酶切鑒定

按照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，并分別用BglⅡ、XhoI酶做酶切鑒定，同時(shí)也做PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.4.6 測(cè)序鑒定

將酶切及PCR擴(kuò)增鑒定正確的克隆送Invitrogen公司測(cè)序分析。

1.2.5 制備病毒上清液

轉(zhuǎn)染前一天，10 cm平皿鋪板HEK293T細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到30～50%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pMSCV-GFP vector或pMSCV-BRD7-GFP和包裝質(zhì)粒E vector、G vector，操作按Lipofectamine2000說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后，收集病毒上清液，用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾得到病毒上清。

1.2.6 病毒上清液的濃縮

按每20 mL病毒上清加入5.5 mL PEG-8000（44%）與2 mL NaCl（4M）的比例充分混勻，使得PEG-8000終濃度為8.5%，NaCl終濃度為0.3 M；靜置4℃過(guò)夜后，3 000 rpm離心15 min；小心吸掉上清，剩下乳白色的病毒沉淀，最后用150μL PBS重懸，保存于-80℃。

1.2.7 穩(wěn)定細(xì)胞株的建立

鋪板U2OS細(xì)胞于6 cm板中，培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)開始感染病毒。每孔加入上述濃縮病毒液，同時(shí)補(bǔ)加培養(yǎng)基置2 mL（含8 μg/mL polybrene），37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后，棄去病毒液，換正常培養(yǎng)基過(guò)夜。培養(yǎng)24 h后，用嘌呤霉素（0.8μg/mL）篩選3天，收集細(xì)胞提取蛋白，Western blotting檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。同時(shí)用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP表達(dá)的分布情況。

1.2.8 Western blotting檢測(cè)

收集U2OS細(xì)胞對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，提取蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度并定量, 用10% 聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜200 mA, 2 h,用含5% 脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，孵育BRD7一抗（1:2000）和GAPDH（1:1 000）4℃過(guò)夜；PBST洗滌3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h；PBST 洗滌同前，X光片壓片，顯影、定影。

2 結(jié)果

2.1 目的基因BRD7的擴(kuò)增

將HEK293T細(xì)胞的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到其cDNA。以該cDNA為模板，用pMSCV-BRD7-F與pMSCV-BRD7-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在2 000 bp左右處有一條明顯的條帶（圖1），與預(yù)期擴(kuò)增的BRD7片段大小相符。

圖1 PCR擴(kuò)增BRD7編碼區(qū)的電泳結(jié)果Figure 1 Encoding region of BRD7 was ampli fi ed by PCR

2.2 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定

將PCR擴(kuò)增的BRD7片段回收后，用BglⅡ與XhoI雙酶切后與同樣經(jīng)雙酶切的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-GFP 載體連接過(guò)夜后，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化后涂LB 氨芐固體平板。待長(zhǎng)出菌落后，挑單個(gè)菌落進(jìn)行小搖，4 h后進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。結(jié)果如圖2所示，在所挑取的4個(gè)單克隆菌落里，其中菌落3在2 000 bp 處有明顯的條帶，說(shuō)明擴(kuò)增的目的片段連接進(jìn)入了目的載體。

圖2 挑選菌落經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果Figure 2 The result of electrophoresis of randomly selected colonies by PCR

2.3 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定

將菌液PCR驗(yàn)證正確連接的重組質(zhì)粒送去Invitrogen公司測(cè)序，以確定連接進(jìn)入載體的目的片段是否與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人類BRD7 cDNA序列一致（中間加測(cè)反應(yīng)的測(cè)序引物序列為BRD7-W1F：AGCTGTTGCACTCAGGAATG）。測(cè)序結(jié)果表明，克隆的BRD7片段成功插入pMSCV-GFP 載體的多克隆位點(diǎn)，而且中間的開放讀碼框序列與GenBank中的BRD7堿基序列完全一致。（圖3，紅色框標(biāo)示為BRD7的起始密碼子位置）。

圖3 pMSCV-BRD7-GFP的測(cè)序結(jié)果Figure 3 The sequencing result of pMSCV-BRD7-GFP

2.4 pMSCV-BRD7-GFP過(guò)表達(dá)穩(wěn)定系的鑒定與功能研究

將濃縮好的病毒顆粒感染U2OS細(xì)胞，24 h后觀察GFP熒光，同時(shí)加入嘌呤霉素（0.8 μg/mL）篩選，72 h后得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株。篩選后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并傳代后觀察GFP熒光表達(dá)的情況，同時(shí)提取細(xì)胞蛋白做Western blotting鑒定。結(jié)果表明，無(wú)論對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組，U2OS細(xì)胞均顯示較強(qiáng)的綠色熒光，說(shuō)明絕大部分的未被感染細(xì)胞都被篩除（圖4A）；同時(shí)，Western blotting的結(jié)果表明，感染含BRD7病毒的細(xì)胞株其內(nèi)源BRD7的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（圖4B）。這些結(jié)果證實(shí)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)BRD7的U2OS細(xì)胞系構(gòu)建成功。利用已構(gòu)建好的BRD7過(guò)表達(dá)穩(wěn)定系，進(jìn)一步分析了其對(duì)增殖與下游靶基因的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BRD7過(guò)表達(dá)穩(wěn)定系的增殖能力顯著低于對(duì)照組，且顯著促進(jìn)下游靶基因p21與MDM2的表達(dá)（圖4B和圖4C）。

圖4 過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的鑒定及功能研究Figure 4 Validation of the overexpression stable cell lines and functional research

3 討論

細(xì)胞周期是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其精確調(diào)控對(duì)于維持基因組穩(wěn)定性以及細(xì)胞正常功能是必要條件[11]。已有研究表明很多種調(diào)節(jié)蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，包括細(xì)胞周期素（cyclins），周期素依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDKs）以及CDK抑制分子[12]。

BRD7目前主要作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能，在其他方面對(duì)其功能的認(rèn)識(shí)甚少。在對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系HNE1研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)BRD7能抑制細(xì)胞的增殖及G1/S期的進(jìn)程，主要通過(guò)影響13個(gè)屬于Ras/MEK/ ERK及Rb/E2F通路的基因表達(dá)：P19-INK4D表達(dá)上調(diào)，MEK、ERK1/2、cyclinD1及E2F3下調(diào)[10,13]。同時(shí)BRD7也能夠通過(guò)上調(diào)α-catenin而阻斷細(xì)胞核里面的β-catenin聚集影響靶基因c-myc、cyclinD1的表達(dá)[10]，也許正因?yàn)榇?，鼻咽癌中BRD7表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致了核β-catenin的異常聚集[14]。 最近又有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，BRD7能直接與BRCA1、Oct1相互作用來(lái)調(diào)節(jié)BRCA1依賴的轉(zhuǎn)錄[15]，BRD7也能與p53相互作用介導(dǎo)一部分p53下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響組蛋白乙?；?，p53乙?；皢?dòng)子活性，因此BRD7主要通過(guò)作為p53互作因子來(lái)發(fā)揮抑制腫瘤形成作用；而且，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在乳腺癌的部分組織中BRD7存在缺失或者低表達(dá)[16]。

在本實(shí)驗(yàn)中我們將BRD7基因成功構(gòu)建在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-GFP上，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)目的基因BRD7序列正確。然后將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒以及對(duì)照質(zhì)粒與兩個(gè)包裝質(zhì)粒G vector、E vector共轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞，收集并濃縮病毒顆粒后感染骨肉瘤細(xì)胞U2OS，最后用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞株。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-GFP上帶有綠色熒光蛋白GFP，我們可以利用GFP的表達(dá)情況很好地來(lái)判定嘌呤霉素篩選的效果。最后，我們通過(guò)Western blotting的方法檢測(cè)篩選后的穩(wěn)定細(xì)胞株中BRD7蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： pMSCV-BRD7-GFP所感染的U2OS細(xì)胞中BRD7表達(dá)水平比對(duì)照組的細(xì)胞表達(dá)量明顯增加，且顯著促進(jìn)下游靶基因p21與MDM2的表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BRD7過(guò)表達(dá)穩(wěn)定系能顯著抑制U2OS細(xì)胞的增殖能力，表明BRD7在骨肉瘤中可能發(fā)揮抑癌基因的功能?？傊狙芯砍晒?gòu)建了能穩(wěn)定高表達(dá)BRD7的細(xì)胞系，并初步研究了其功能，為進(jìn)一步研究BRD7在細(xì)胞周期中被調(diào)控的機(jī)制與功能奠定基礎(chǔ)。

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Construction of BRD7 retroviral stable cell line and the evaluation of its biological functions

ZHANG Ruhua, HU Kaishun, WU Yuanzhong, KANG Tiebang★
(Department of Experimental Research, State Key Laboratory of Oncology in South China, Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangdong, Guangzhou 510060, China)

ObjectiveTo study the tumor suppressor role of BRD7 (bromodomain-containing protein 7).MethodsThe BRD7 gene based on the coding sequence from GenBank was ampli fi ed by RT-PCR. Then the PCR harvested product was suffered to endonuclease digestion and ligation. After transformation to competent cell DH5α，the recombinant positive plasmid clones were identi fi ed by colony-PCR and sequencing analysis. The expressing plasmid were cotransfected into 293T cells, the harvested supernatant was subjected to infect U2OS cells, which will further be selected with puromycin.ResultsColony-PCR and DNA sequencing result indicated that pMSCV-BRD7-GFP vector has been constructed successfully. The GFP fl uorescence showed that there are nearly no untransfected cells remained. Western blotting showed that the protein level of BRD7 in pMSCV-BRD7-GFP transfected cancer cell line is signi fi cantly up-regulated compared with control cancer cell lines. Biological function study showed that overexpression of BRD7 signi fi cantly inhibited the proliferation of U2OS cells and enhanced the expression of target genes p21 and MDM2.ConclusionThe overexpression cancer cell line of pMSCV-BRD7-GFP is successfully constructed. BRD7 may function as a tumor suppressors. Therefore, it provided a new foundation for further mechanism and functional study.

BRD7; Retroviral vector; Stable cell line; Tumor suppressor

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973課題）（2010CB912201）

中山大學(xué)腫瘤防治中心實(shí)驗(yàn)研究部，華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東，廣州 510060

★通訊作者：康鐵邦，E-mail: kangtb@mail.sysu.edu.cn