張鳳銀，戴希剛，潘 磊

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

藜豆種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分子標(biāo)記分析

張鳳銀，戴希剛，潘 磊

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

利用ISSR標(biāo)記構(gòu)建了9份藜豆種質(zhì)的指紋圖譜，并對其遺傳多樣性進(jìn)行評價。結(jié)果表明，從35條引物中篩選出8條重復(fù)性好的多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出64條帶，其中多態(tài)性條帶50條，多態(tài)性比例為78.1%。應(yīng)用其中3條多態(tài)性ISSR引物（UBC889、UBC812、UBC825）的12條特異性條帶，可以有效區(qū)分供試的9份藜豆種質(zhì)資源。藜豆種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.47～0.97之間。利用UPGMA聚類分析，在相似性系數(shù)為0.73處可將9個藜豆種質(zhì)資源劃分為3個類群，其親緣關(guān)系與種質(zhì)地理來源之間存在一定關(guān)聯(lián)性。

藜豆；種質(zhì)資源；遺傳多樣性；ISSR；相似系數(shù)；聚類分析

藜 豆（Stizolobium cochinchinensis）（2X=2N=22），別名貓豆、狗爪豆等，屬豆科藜豆屬一年生草質(zhì)藤本植物，具有食用［1］、藥用［2］、家畜飼料［2］等多種用途。該種原產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國的分布區(qū)域包括廣東、海南、廣西、四川、貴州、湖北和臺灣等省區(qū)。前人對藜豆的研究主要集中在栽培生理及左旋多巴含量、提取方法等方面［3-4］，而對其遺傳多樣性方面的研究鮮見報道。

分子標(biāo)記是分析種質(zhì)遺傳多樣性的有效手段［5-7］，與形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和蛋白質(zhì)標(biāo)記相比較，分子標(biāo)記直接以核酸作為研究對象，在植物體的各個組織、各個發(fā)育時期均可檢測，不受發(fā)育階段、環(huán)境限制，方法可靠，揭示多態(tài)性水平高［8］。ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，簡單重復(fù)序列區(qū)間）是1994年由加拿大蒙特利爾大學(xué)的Ziet?kiewicz等［9］在微衛(wèi)星分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合了RADP和SSR的優(yōu)點，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、顯性標(biāo)記、成本較低、模板用量少等特點。目前，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物［10］、蔬菜［11］、果樹［12］、牧草［13］等植物的遺傳多樣性、親緣關(guān)系、遺傳作圖、基因定位等方面的研究。

本研究利用ISSR標(biāo)記對9份藜豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，對相應(yīng)資源建立特異性的指紋圖譜，以期為科學(xué)合理地保護(hù)和利用藜豆種質(zhì)資源提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，為利用分子標(biāo)記輔助育種手段培育藜豆新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

9份 藜 豆 種 質(zhì) 資 源 LD-1、LD-2、LD-3、LD-4、LD-5、LD-6、LD-7、LD-8、LD-9（分別記為1、2、3、4、5、6、7、8、9）作為本研究的試驗材料，其來源及主要性狀列于表1。對9份藜豆種質(zhì)資源進(jìn)行穴盤育苗，待幼苗長至2片真葉時，每份材料隨即選取5株取其嫩葉備用。

1.2 DNA提取

采用改良的CTAB法［14］提取藜豆基因組DNA。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度后，置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及檢測

根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物序列，由金斯瑞生物科技有限公司合成。利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系從35條ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)和重復(fù)性好的8條ISSR引物（表2）。基于8條多態(tài)性ISSR引物分別對9份藜豆材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系中各反應(yīng)物含量為：20 ng模板DNA，2μL 10×Buffer，1U Taq DNA聚合酶，0.4 μM 引物，0.20 mM dNTPs.PCR擴(kuò)增在 PTC-100TM（Bio-Rad，USA）PCR儀上進(jìn)行，采用touchdown擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行下列循環(huán)：94℃變性30 s，最佳退火溫度下復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后于72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳（TBE電泳緩沖液，0.5 μg/L EB）檢測，在80 V恒壓下電泳約1 h，用DL2000 DNA Marker（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）作分子量標(biāo)準(zhǔn)，在凝膠成像系統(tǒng)儀中拍照記錄電泳圖譜。

表1 供試藜豆種質(zhì)材料來源及其主要性狀

表2 ISSR引物序列及多態(tài)性分析

1.4 數(shù)據(jù)處理與指標(biāo)計算

選取清晰ISSR電泳圖譜，采用0/1賦值記帶，有帶的記為1，無帶或彌散的條帶記為0，匯總建立0/1矩陣數(shù)據(jù)庫。利用NTSYS-pc 2.10軟件統(tǒng)計ISSR數(shù)據(jù)的遺傳相似系數(shù)（GS），用UPMGA法進(jìn)行聚類分析并繪出聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜豆種質(zhì)資源ISSR遺傳多樣性分析

從35條ISSR引物中篩選出能夠產(chǎn)生穩(wěn)定、清晰多態(tài)性擴(kuò)增條帶的8條引物進(jìn)行分析（表2），PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1?；谶@8條多態(tài)性ISSR引物在9份藜豆資源材料中共擴(kuò)增出64個條帶，平均每條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為8條，其中引物UBC889擴(kuò)增的條帶數(shù)最多，為12條，而引物UBC808擴(kuò)增的條帶數(shù)最少，只有4條。在所獲得的64個條帶中多態(tài)性條帶有50條，其多態(tài)性比率為78.1%，其中引物UBC825的多態(tài)性比率最高為100%，而引物UBC808的多態(tài)比率最低，僅有50%。

2.2 供試種質(zhì)的指紋圖譜

電泳結(jié)果表明，不同ISSR引物在供試的9份藜豆種質(zhì)資源之間檢測到不同的分子指紋圖譜。其中，3條多態(tài)性ISSR引物（UBC889、UBC812、UBC825）能有效區(qū)分不同基因型。UBC889引物檢測到的多態(tài)性條帶中有4個條帶（560，750，1 500，1 800 bp）能區(qū)分 LD-4、LD-5、LD-6和LD-8（圖1），因為750 bp條帶為LD-4所特有，LD-5缺失560 bp條帶，LD-6有560 bp條帶，而無750 bp條帶，LD-8同時缺失1 500 bp和1 800 bp條帶。UBC812引物檢測到的多態(tài)性條帶中有3個條帶（580，660，1 600 bp）能區(qū)分LD-1、LD-2和LD-4（圖2）。在LD-1和LD-2均有1 600 bp條帶，而其他7份樣品則沒有此帶，在LD-4中同時缺580 bp和660 bp條帶。UBC825引物檢測到的多態(tài)性條帶中有5個條帶（250，570，625，1 900，2 000 bp）能區(qū)分 LD-1、LD-3、LD-7和LD-8（圖3）。LD-1中無570 bp條帶，LD-3中同時缺失1 900 bp和2 000 bp條帶。LD-7中缺失同時缺失250 bp和570 bp條帶，而LD-8中同時缺失570 bp和625 bp條帶。因此，綜合運用上述3條多態(tài)性ISSR引物檢測到的12條特異性條帶，可以有效區(qū)分供試的9份藜豆種質(zhì)資源。

2.3 遺傳相似性與聚類分析

供試材料間的遺傳相似系數(shù)（GS）見表3。通過遺傳相似系數(shù)計算出遺傳距離（GD=1-GS）。遺傳相似系數(shù)大，遺傳距離短，表明種質(zhì)之間的親緣關(guān)系近，反之，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。9個藜豆種質(zhì)資源之間的相似系數(shù)范圍為0.47～0.97。其中同來自廣西東蘭縣的主栽品種花籽藜豆LD-1和灰籽藜豆LD-2的相似系數(shù)最大，為0.97，遺傳距離最短，親緣關(guān)系最近。來自四川的黑籽白花藜豆的LD-5和來自廣東的花籽紫花藜豆LD-9的遺傳相似系數(shù)次之，為0.91。而同來自廣西東蘭縣的LD-2和LD-8之間的相似系數(shù)最小，為0.47，遺傳距離最遠(yuǎn)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖1 引物UBC889的ISSR擴(kuò)增圖譜

圖2 引物UBC812的ISSR擴(kuò)增圖譜

圖3 引物UBC825的ISSR擴(kuò)增圖譜

系統(tǒng)聚類圖（圖4）可以直接反映9份種質(zhì)的親緣關(guān)系，聚類圖顯示，若以相似系數(shù)0.73為閾值，可將9份藜豆種質(zhì)資源劃分為3類。第1類包括 LD-1、LD-2、LD-3；第 2類包括 LD-4、LD-5、LD-6、LD-7、LD-9；第 3類包括 LD-8。從聚類結(jié)果來看，9份藜豆材料分為3大類，但并非來自同一地區(qū)的種質(zhì)歸為同一類，如LD-1、LD-2、LD-3、LD-4、LD-8均來自廣西，前3種歸為1類，而后兩者分別歸為另2類。說明聚類的結(jié)果與地理來源有一定相關(guān)性，但并不密切，這說明藜豆種質(zhì)資源有較高的遺傳變異性，存在著較大的選育潛力。

表3 藜豆種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)矩陣

圖4 藜豆種質(zhì)資源的聚類分析圖

3 討論

由于ISSR標(biāo)記具有信息量豐富、操作簡單、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等諸多優(yōu)點，因而被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性的研究中。曾亮等［15］利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對來自國內(nèi)外的73份豌豆材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)11條有效引物共擴(kuò)增出91個位點，其中多態(tài)性位點78個，多態(tài)性比率為86.4%，聚類結(jié)果顯示，來源相近的材料聚為1類，呈現(xiàn)出一定的地域性分布規(guī)律。高山等［16］采用ISSR標(biāo)記技術(shù)對源自中國7個省份的38份瓠瓜（Lagenaria sicerari）種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，12個ISSR引物共擴(kuò)增出96條多態(tài)性帶，多態(tài)性比率平均為83.5%，聚類結(jié)果與瓠瓜的農(nóng)藝性狀分類和地理分布有一定的相關(guān)性。本研究也得出相似的結(jié)果。在本研究中，對9份藜豆種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)對8條重復(fù)性好的多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出64條帶，其中多態(tài)性條帶50條，多態(tài)性比例為78.1%，這表明藜豆種質(zhì)資源具有遺傳多樣性。從聚類圖可以看出，在相似系數(shù)約為0.73處，將9份材料聚為3類，聚類基本符合地理來源相近的品種聚為1類。但也有相同地理來源的品種未歸為1類，如 LD-1、LD-2、LD-3、LD-4、LD-8均來自廣西，前3種歸為1類，而后兩者分別歸為另2類。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能有2個方面：

1）地理來源相同的材料雖來自同一環(huán)境，但由于選擇方向的不同和選用育種材料的錯綜復(fù)雜，也可能形成遺傳差異較大的類型，因此出現(xiàn)地理來源相同的品種被歸入不同類群；

2）受環(huán)境飾變作用的影響，物種在長期適應(yīng)環(huán)境的過程中會出現(xiàn)某些性狀趨同的現(xiàn)象，造成不同物種性狀間的交叉。

致謝：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院熊善柏教授及廣西農(nóng)科院陳彩虹研究員、高國慶研究員在收集藜豆種質(zhì)資源時給予了大力幫助，謹(jǐn)致謝意。

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Genetic Diversity Analysis of Velvet Bean Germplasm Resources with ISSR Markers

ZHANG Feng-yin，DAI Xi-gang，PAN Lei
（School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Constructed the fingerprint of 9 velvet bean（Stizolobium cochinchinensis）germ?plasm resources and analyse their genetic diversity with ISSR markers.The results indicated that 8 primers with strong stability and repeatability were screened from 35 primers and carried out PCR amplification.64 bands were amplified from 9 velvet bean varieties，among which 50 were polymor?phic，and the polymorphic rate was up to 78.1%.Using 12 specific bands in the 3 polymorphic ISSR primers（UBC889、UBC812、UBC825），the 9 velvet bean germplasm resources could be differentiat?ed.The genetic similarity coefficients of velvet bean germplasm ranged from 0.47 to 0.97.Nine vel?vet bean varieties were divided into 3 groups by UPGMA cluster analysis with the similarity coeffi?cient of 0.73.The phylogenetic relationship of velvet beans are partly related to the geological sourc?es of the germplasm.

velvet bean；germplasm resources；genetic diversity；ISSR；similarity coeffi?cient；cluster analysis

S643.9

：A

：1673-0143（2013）06-0100-05

（責(zé)任編輯：陳 曠）

2013－09－22

湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心開放基金項目（2012-01）；武漢市科技攻關(guān)計劃項目（201120822281）；武漢市科技攻關(guān)計劃項目（2013021001010478）

張鳳銀（1964—），女，副教授，研究方向：園藝植物遺傳育種。