朱天輝，李姝江，向?yàn)t瀟，譙天敏

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川 雅安 625014)

地衣芽孢桿菌(Bacillus lincheniformis)，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，是一種革蘭氏陽性細(xì)菌［1］，在自然界分布非常廣泛，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢種群［2］。它對(duì)多種植物病原菌有很強(qiáng)的抑制作用，如對(duì)鐮刀菌、核盤菌、稻瘟病病菌和水稻紋枯病病菌等具有較強(qiáng)的抑菌活性，表現(xiàn)出很好的生防潛力［3～8］。在對(duì)番茄灰霉病的田間防效試驗(yàn)中，地衣芽孢桿菌與化學(xué)藥劑腐霉利效果相當(dāng)，可達(dá)60%以上［9］;并且還具有在番茄植株體表定殖競爭能力［10］和誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的能力［11］;可以產(chǎn)生多種抗生物質(zhì)，其抗菌蛋白對(duì)蘋果輪紋病菌、炭疽病菌的抑制作用使其對(duì)輪紋病具有防治作用［12］。

地衣芽孢桿菌YB15是從健康的撐×綠雜交竹上分離獲得的一株對(duì)撐×綠雜交竹梢枯病病原菌(暗孢節(jié)菱孢菌)有很好的抑制作用的優(yōu)勢拮抗菌株。本試驗(yàn)旨在對(duì)地衣芽孢桿菌YB15 的發(fā)酵培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為撐×綠雜交竹梢枯病生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

拮抗菌:地衣芽孢桿菌YB15(Bacillus lincheniformis)

病原菌:暗孢節(jié)菱孢菌(Arthrinium phaeospermum)(森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室)

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g～20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml，0.1 MPa 滅菌30 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基):牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml，pH 值7.0，0.1 MPa 滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌與拮抗菌的處理

將實(shí)驗(yàn)室保存的暗孢節(jié)菱孢菌接種到新鮮的PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)，直到病原菌長滿，取出，用5 mm 直徑打孔器打孔得菌餅，待用。

取培養(yǎng)48 h 的地衣芽孢桿菌YB15 斜面，用10 ml 無菌水將其洗下，作為發(fā)酵種子液，取其3 ml 接入100 ml 的牛肉膏蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，25 ℃，140 r·min－1旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)72 h，待用。

1.2.2 抑菌活性的測定

地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵無菌濾液的制備:取25 ℃，140 r·min－1旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)72 h 后的發(fā)酵液，于4℃下6 000 rpm 離心10 min，取其上清液，過0.22 μl的細(xì)菌過濾器，得到無菌濾液。

抑菌活性測定采用孔洞法，將暗孢節(jié)菱孢菌餅接種到PDA 平板中央，在距菌餅1 cm 相互垂直的4個(gè)方向，用5 mm 打孔器打孔，其中3個(gè)孔中加入80 μl 地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵無菌濾液，另外一個(gè)孔加入等量無菌水做對(duì)照，然后進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，4 d 后測定抑菌圈直徑。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素試驗(yàn)

碳源:分別選擇葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、糊精等，等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，25℃，140 r·min－1旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48 h，測定不同碳源對(duì)地衣芽孢桿菌YB15 抑菌活性的影響。

氮源:分別以酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏、氯化銨、硫酸銨、牛肉膏+蛋白胨、酵母浸膏+蛋白胨、酵母浸膏+蛋白胨+氯化銨、酵母浸膏+蛋白胨+硫酸銨等，等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，25 ℃，140 r·min－1旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48 h，測定不同氮源對(duì)地衣芽孢桿菌YB15 抑菌活性的影響。

無機(jī)鹽:分別以磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸鈣、硝酸鉀等，等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氯化鈉，25 ℃，140 r·min－1旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48 h，測定不同無機(jī)鹽對(duì)地衣芽孢桿菌YB15 抑菌活性的影響。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)基組分的優(yōu)化，每種培養(yǎng)基3次重復(fù)，測定不同培養(yǎng)基組分配比對(duì)地衣芽孢桿菌YB15 抑菌活性的影響，正交試驗(yàn)因素編碼表設(shè)計(jì)如下(見表1)。

表1 地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)因素編碼表

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化

結(jié)合發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)的最優(yōu)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)基條件的優(yōu)化，每種培養(yǎng)基3次重復(fù)，測定不同發(fā)酵條件對(duì)地衣芽孢桿菌YB15抑菌活性的影響，正交試驗(yàn)因素編碼表設(shè)計(jì)如下(見表2)。

表2 地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)因素編碼表

1.2.6 生長曲線的測定

以培養(yǎng)基優(yōu)化后的最優(yōu)方案處理以下各培養(yǎng)基，將4 ml 發(fā)酵種子液轉(zhuǎn)入100 ml 最優(yōu)培養(yǎng)基中(共21 瓶)于25 ℃，140 r·min－1搖床培養(yǎng)。每6 h取出一瓶，以分光光度法在波長650 nm 處測出各發(fā)酵液OD 值，以培養(yǎng)0 h 的發(fā)酵液OD 值為對(duì)照，測定時(shí)間為0～102 h。最后以發(fā)酵時(shí)間(h)為橫軸，以各無菌發(fā)酵液的OD 值為縱軸繪出生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的單因素試驗(yàn)

從圖1可以看出，當(dāng)使用麥芽糖和葡萄糖作為碳源，等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，地衣芽孢桿菌YB15 的抑菌圈直徑都較大，抑菌活性都較強(qiáng)，但效果相差不大，而葡萄糖則更加經(jīng)濟(jì)易得。所以，地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源是葡萄糖。

從圖2可以看出，當(dāng)使用酵母浸膏+蛋白胨+硫酸銨等作為氮源，等量代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，地衣芽孢桿菌YB15 的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最強(qiáng)。所以，地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源是酵母浸膏+蛋白胨+硫酸銨。

圖1 不同碳源對(duì)地衣芽孢桿菌YB15 抑菌活性的影響

圖2 不同氮源對(duì)地衣芽孢桿菌YB15 抑菌活性的影響

從圖3可以看出，當(dāng)使用原基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，地衣芽孢桿菌YB15 的抑菌圈直徑最大，抑菌活性最強(qiáng)。所以，地衣芽孢桿菌YB15發(fā)酵培養(yǎng)基的最適無機(jī)鹽仍為氯化鈉。

圖3 不同無機(jī)鹽對(duì)地衣芽孢桿菌YB15 抑菌活性的影響

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化

正交試驗(yàn)培養(yǎng)基組分優(yōu)化的方差分析顯示(見表3)，以上各不同處理導(dǎo)致地衣芽孢桿菌YB15 的抑菌圈直徑差異極顯著。SSR 法對(duì)各處理進(jìn)行多重比較，結(jié)果表明(見表4)，9種不同處理中以3 號(hào)處理的抑菌圈直徑最大，且顯著大于其他處理，因此發(fā)酵培養(yǎng)基的最適配比為葡萄糖5.0 g，酵母浸膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，硫酸銨5.0 g。

表3 地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)方差分析

表4 地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵培養(yǎng)基組分多重比較

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化

正交試驗(yàn)的發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化方差分析(表5)表明，以上各不同發(fā)酵條件導(dǎo)致地衣芽孢桿菌YB15的抑菌圈直徑差異極顯著。

各發(fā)酵條件因素進(jìn)行單因素方差分析結(jié)果(表6)顯示，不同溫度導(dǎo)致的地衣芽孢桿菌YB15 抑菌圈直徑差異極顯著，而不同pH、瓶裝量和接種量之間差異不顯著。

表5 地衣芽孢桿菌YB15 發(fā)酵培養(yǎng)基條件正交試驗(yàn)方差分析

表6 發(fā)酵條件單因素方差分析

SSR 法對(duì)溫度各不同處理進(jìn)行多重比較(見表7)，顯示2 號(hào)處理的抑菌圈直徑最大，因此地衣芽孢桿菌YB15 的發(fā)酵培養(yǎng)的最適條件為2 號(hào)處理，即25 ℃，pH 值為6.5，瓶裝量為100 ml，接種量為4 ml。

表7 不同溫度處理的多重比較

2.4 生長曲線的測定

由圖4可知，在以上實(shí)驗(yàn)得出的發(fā)酵培養(yǎng)基最適組分和培養(yǎng)最適條件下，發(fā)酵種子液接入最優(yōu)培養(yǎng)基0～6 h 為菌體生長延遲期，鏡檢可見菌體小、數(shù)量極少;從6 h 以后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，鏡檢結(jié)果菌體數(shù)量急劇增多，菌體形態(tài)增大增長，并開始形成芽孢;在18 h 以后，地衣芽孢桿菌處于生長的穩(wěn)定期，菌體生長緩慢，鏡檢可知菌體全部形成芽孢，孢囊略為膨大。地衣芽孢桿菌YB15 的發(fā)酵周期為18 h～20 h。所以應(yīng)在12 h～18 h 時(shí)收集菌體，因?yàn)檫@時(shí)地衣芽孢桿菌YB15 處于對(duì)數(shù)生長末期，此時(shí)收集菌體既可保持較高的細(xì)胞活性，又可得到盡可能多的細(xì)胞數(shù)。

圖4 地衣芽孢桿菌YB15 生長曲線

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用單因素實(shí)驗(yàn)法確定了地衣芽孢桿菌(Bacillus lincheniformis)YB15 發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無機(jī)鹽的最適組分，并通過正交試驗(yàn)得出發(fā)酵培養(yǎng)基組分的最適配比為葡萄糖5.0 g，酵母浸膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，硫酸銨5.0 g。另外，最適培養(yǎng)條件為25 ℃，pH 值為6.5，瓶裝量為100 ml，接種量為4 ml。在此優(yōu)化條件下，地衣芽孢桿菌YB15 的生長對(duì)數(shù)期為6 h～18 h，收集菌體的最佳時(shí)間為12 h～18 h。發(fā)酵周期為18 h～20 h，與豐貴鵬和楊麗云［13］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵周期為22 h～24 h 相比，縮短了4 h，比經(jīng)驗(yàn)周期縮短了14 h;與劉瑩等［14］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中從21 h 開始進(jìn)入衰亡期相比，大大延長了地衣芽孢桿菌的穩(wěn)定期;谷春濤［15］研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌TS－01 的最適生長溫度為40 ℃，且微量MnSO4可促進(jìn)其產(chǎn)孢量的增減。眾多關(guān)于地衣芽孢桿菌發(fā)酵條件研究結(jié)果有所差異，可能是由于不同生理小種的特性不同，或者是環(huán)境條件各異，具體原因有待進(jìn)一步的探討。

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