譚 芳，黃 璐，鄭 琦，陳 燃

（江漢大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056）

HPLC法測定奶粉中痕量炔雌醇

譚 芳，黃 璐，鄭 琦，陳 燃

（江漢大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056）

建立了高效液相色譜（HPLC）法測定奶粉中炔雌醇?xì)埩袅康姆椒?。樣品以乙腈振蕩萃取、離心，提取液濃縮后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，冷凍去脂，進(jìn)高效液相色譜儀分析。研究了萃取溶劑、萃取及濃縮方式對萃取效率的影響，確立了色譜檢測條件。乙腈-水（50∶50）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長224 nm。方法的檢出限為16 μg/kg，加標(biāo)回收率在86.5%～97.0%之間，工作曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999 0，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%～2.01%（n=3）。方法快速、靈敏度高、分離效果好，樣品處理簡單、無雜質(zhì)干擾，能夠滿足奶粉中雌激素分析的需要。

HPLC；奶粉檢測；炔雌醇；食品安全

牛奶中所含雌激素過高將導(dǎo)致兒童性早熟，也致使成年人發(fā)生乳腺或者婦科腫瘤以及前列腺癌［1-2］。因此，快速準(zhǔn)確地檢測牛奶制品中的雌激素對于保障食品安全十分必要。目前，國家出臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)中［3-4］，僅對牛奶中的雌激素建立了檢測方法，而奶粉的檢測方法尚無現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)。由于奶粉配方基質(zhì)復(fù)雜，激素殘留量低，建立快速、準(zhǔn)確的方法來解決奶粉中的雌激素檢測問題很有必要。筆者對奶粉中的炔雌醇進(jìn)行提取、凈化處理，建立了高效液相色譜法分析奶粉中炔雌醇的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 DIONEX高效液相色譜儀（配有GP50型梯度泵，TCC-100柱溫箱，UVD170U型紫外檢測器），美國戴安公司；色譜柱：Thermo C18柱（250 mm×0.46 mm，5 μm），美國熱電公司；HZQ-C空氣浴振蕩器，金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠；800型低速離心沉淀機(jī)，中國深圳國華儀器廠；微孔濾膜（孔徑 0.45 μm）；DENVER instru?ment電子天平；離心管（10 mL，具塞帶刻度）。

1.1.2 試劑 對照品炔雌醇由德國進(jìn)口；甲醇、乙腈為色譜純；無水乙醇為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

精密稱取炔雌醇對照品25 mg，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇振搖使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液，存放于冰箱備用。樣品為市場購得的孕婦奶粉、嬰幼兒配方奶粉、中老年?duì)I養(yǎng)奶粉。

1.2 樣品處理

稱取2.0 g奶粉試樣于50 mL離心管中，加25 mL乙腈混勻，置于空氣浴振蕩器振蕩萃取20 min，4 000 r/min離心10min，吸取上層清液，用過濾膜過濾，收集濾液置于-24℃下冷凍4 h，用過濾膜操作去除脂肪。精密量取萃取液10 mL，30℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，加無水乙醇定容至0.2 mL，進(jìn)入液相色譜儀分析檢測。

1.3 色譜條件

流速1 mL/min；柱溫30℃；流動(dòng)相：乙腈-水（50∶50）為流動(dòng)相；檢測波長224 nm；進(jìn)樣量20 μL。在選定色譜條件下，對照品色譜圖見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)比較了70%甲醇（體積比，流動(dòng)相為甲醇-水）和50%甲醇，以及40%乙腈（體積比，流動(dòng)相為乙腈-水）、50%乙腈、60%乙腈條件下，對比炔雌醇標(biāo)準(zhǔn)液的檢測效果，發(fā)現(xiàn)甲醇作為流動(dòng)相有機(jī)相時(shí)基線不穩(wěn)定，干擾較大。而在50%乙腈條件下，同時(shí)選擇不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜檢測，炔雌醇保留時(shí)間較為合適，且在不同濃度下，目標(biāo)峰周圍無雜質(zhì)干擾，峰寬適宜，所以最終確定選擇乙腈-水（50∶50）作為流動(dòng)相。

圖1 炔雌醇對照品色譜圖

2.2 波長的選擇

在200～800 nm波長光譜掃描炔雌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)現(xiàn)，炔雌醇有兩個(gè)吸收峰，分別在224 nm處和280 nm處，而224 nm處吸收峰信號更強(qiáng)一些。而在此波長下進(jìn)行HPLC檢測，雜質(zhì)干擾也較小，可以獲得更高的靈敏度，因此選擇224 nm作為檢測波長。

2.3 萃取劑的選擇

奶粉樣品主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪，同時(shí)也是干擾物的主要來源，因此奶粉中蛋白質(zhì)和脂肪的去除以及待測組分的提取是樣品前處理過程的關(guān)鍵。參照各種相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)［5］，萃取劑一般為乙酸乙酯、乙醇、乙腈和氯仿。通過實(shí)驗(yàn)探索發(fā)現(xiàn)，乙醇萃取離心后溶液仍較渾濁，過濾膜阻力較大；乙酸乙酯旋蒸后呈深土黃色，雜質(zhì)干擾太多；氯仿萃取后，由于脂肪易溶于氯仿，造成干擾，且提取回收率很低，不能滿足實(shí)驗(yàn)要求；乙腈提取后溶液澄清，干擾少，回收率也較高，因此本實(shí)驗(yàn)確定乙腈作為萃取劑。

2.4 萃取方式的選擇

在實(shí)驗(yàn)中考察了固相萃取及液相萃取的條件，發(fā)現(xiàn)固相萃取雖然可以去除一些雜質(zhì)，但回收率卻降低了很多，而液相萃取后直接進(jìn)樣，雜質(zhì)干擾較小。液相萃取過程中又同時(shí)比較振蕩萃取和超聲萃取的區(qū)別，最終發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲和振蕩時(shí)間超過30 min，回收率差異較小，但超聲萃取后溶液容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，離心后溶液比較渾濁，過濾膜阻力特別大，故而最終選擇了振蕩萃取。

2.5 濃縮方式的選擇

由于一般食品中雌激素含量低，一般儀器很難檢測出，因此選擇有效的濃縮富集方式非常重要。由于固相萃取富集效果不太理想，有效成分損失較大，又由于萃取液量較多，不適合選用氮吹儀，因此濃縮方式選擇水浴蒸干和旋轉(zhuǎn)蒸干兩種，但普通的水浴蒸干，所需時(shí)間很長，蒸干殘?jiān)懈蓴_雜質(zhì)多，原因可能是長時(shí)間在高溫蒸干過程發(fā)生了復(fù)雜的反應(yīng)，溶液吸光度會(huì)隨溫度增高而增大，目標(biāo)提取物也會(huì)因此損失。而旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀是在真空低溫下進(jìn)行，一般不會(huì)改變物性，且時(shí)間較快，只需要5～10 min，具有較明顯的優(yōu)勢，因此確立選擇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀來蒸干萃取液。

2.6 方法的線性范圍、檢出限、定量限

精密量取炔雌醇貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0 mL，分別置于50 mL的容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得到2.5，5.0，10，15，25 μg/mL濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色譜條件下分別進(jìn)樣。采用外標(biāo)法，根據(jù)峰面積與濃度的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限，以10倍信噪比（S/N）計(jì)算定量限。線性方程為C=2.743 9A+0.315 9，相關(guān)系數(shù)0.999 0，方法的檢出限為 16 μg/kg，定量限為 60 μg/kg。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出線性關(guān)系良好。

2.7 方法的回收率與精密度

取奶粉樣品2.0 g，分別加入2.5 mL炔雌醇濃度為5.0，25，250 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按照1.2實(shí)驗(yàn)方法處理，每組平行3次實(shí)驗(yàn)，分別得到低中高3個(gè)濃度下的回收率，所得結(jié)果如下表1。

表1 加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

從表1可知，加標(biāo)回收率在86.5%～97.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%～2.01%（n=3），可見本實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度與精密度良好。

2.8 樣品分析

采用本法對市售3個(gè)品牌的孕婦奶粉、嬰幼兒配方奶粉、中老年?duì)I養(yǎng)奶粉進(jìn)行測定，所有樣品均低于本方法檢出限，均未檢出炔雌醇，同時(shí)在檢測過程中，未發(fā)現(xiàn)有其他明顯的干擾。

3 結(jié)論

應(yīng)用建立的HPLC法測定奶粉中炔雌醇?xì)埩?，加?biāo)回收率在86.5%～97.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.95%～2.01%（n=3），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法試劑用量少，無較多的干擾物產(chǎn)生，操作簡單、快速、準(zhǔn)確、成本低。HPLC法應(yīng)用于奶粉中炔雌醇?xì)埩袅康臋z測，可以得到滿意的結(jié)果。

［1］ 沈珺，徐瑩.淺論牛乳中的雌激素［J］.黑龍江科技信息，2011（27）：184.

［2］ 袁麗君，徐莊劍，許祥生.牛奶中的雌激素及其安全性［J］.國際內(nèi)科學(xué)雜志，2007，34（4）：712-714.

［3］ 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 21981-2008.動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測方法（液相色譜-質(zhì)譜法）［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部1031號公告-1-2008.動(dòng)物源性食品中11種激素殘留檢測液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［5］ 劉勇軍，吳銀良，姜艷彬，等.固相萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定牛奶中的炔雌醇［J］.畜牧與獸醫(yī)，2007，39（9）：53-54.

Determination on Residue of Ethinylestradiol in Powdered Milk with HPLC

TAN Fang，HUANG Lu，ZHENG Qi，CHEN Ran
（School of Chemistry and Environmental Engineering，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

A method was developed for the determination of ethinylestradiol residue in pow?dered milk with HPLC.Samples were extracted with acetonitrile，contrifugated，the extract was fil?trated with 0.45 μm filter membrane after being concentrated，freezed and degreased，then carried out HPLC analysis.Extraction solution，extraction method and HPLC condition were optimized.Used acetonitrile-water（50∶50）as the mobile phase，flowing speed was 1 mL/min，column tempera?ture was 30℃，detective wavelength was 224 nm.The detection limit of the method was 16 μg/kg，the recovery was 86.5%-97.0%，the related coefficient of the working curve was 0.999 0，the rela?tive standard deviation was 0.95%-2.01%（n=3）.The method is rapid，sensitive，good seperation effect，simple，no disturbance from impurity，can meet the request of etinylestradiol dectection in powdered milk.

HPLC；detection on powdered milk；ethinylestradiol；food security

O657.72

：A

：1673-0143（2013）06-0031-03

（責(zé)任編輯：葉 冰）

2013－10－21

湖北省科技廳項(xiàng)目（2011CDC130）；武漢市科技局項(xiàng)目（201220837304-3）

譚 芳（1973—），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：儀器分析教學(xué)與科研。