劉新彥，霍占江，牛敬蓮，王 暉，劉曉燕，張廷錄

鼻息肉是在多種因素共同作用下鼻粘膜的慢性炎癥病變，病理表現(xiàn)為以嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)為主的多種炎細(xì)胞浸潤(rùn)［1］。嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin)是EOS 特異性趨化因子，通過(guò)與EOS上的CC 家族趨化因子受體3(CCR3)特異性結(jié)合，促進(jìn)EOS 在氣道聚集及原位激活，從而引起氣道病變發(fā)生。有研究證實(shí)，鼻腔局部應(yīng)用糖皮質(zhì)激素能直接抑制鼻粘膜EOS 的活化，抑制鼻息肉生長(zhǎng)，防止息肉術(shù)后復(fù)發(fā)的作用［2］。本文旨在研究鼻噴激素對(duì)鼻息肉組織中EOS 浸潤(rùn)情況及Eotaxin-2 mRNA 表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011 年2 -8 月擬在我院接受鼻內(nèi)鏡手術(shù)的鼻息肉患者24 例，隨機(jī)分成激素治療組和未治療組，每組12 例。激素治療組(男7例，女5 例，平均年齡38.14 歲)應(yīng)用曲安奈德鼻噴霧劑噴鼻治療6 ～8 周(110 μg/次，1 次/d)。未治療組(男6 例，女6 例，平均年齡42.53 歲)未采取任何治療措施，只隨訪觀察。所有患者治療及觀察結(jié)束后，均于全麻下行經(jīng)鼻內(nèi)鏡鼻息肉摘除術(shù)，所有標(biāo)本手術(shù)切除后分為2 份:1 份立即置于-196 ℃液氮冷凍后，置于-70 ℃冰箱中冰凍保存?zhèn)溆?1 份制作石蠟標(biāo)本，并由2 位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師閱片，證實(shí)診斷。

1.2 方法 采用RT-PCR 方法分別檢測(cè)兩組鼻息肉組織中Eotaxin-2 mRNA 的表達(dá)水平。

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank 公布的Eotaxin-2 及β-actin 基因全長(zhǎng)cDNA 序列的資料，借助于計(jì)算機(jī)軟件Primer Premier 5.0、Oligo 6.5各設(shè)計(jì)了2 條引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。Eotaxin-2 正向引物:5p GGAGTGGGTCCAGAGGTACATTA 3p，反向引物:5p GCAGGTGGTTTGGTTGC 3p，擴(kuò)增124 bp;內(nèi)參照β-actin 正向引物:5p ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 3p，反向引物:5p CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3p，擴(kuò)增318 bp。

1.2.2 組織總RNA 的提取 取鼻息肉冰凍標(biāo)本每組約50 mg，分別加TRIZOL 1 mL，4 ℃勻漿，搖勻，放置5 min。將各組消化好的組織裂解液吸到DEPC 處理過(guò)的1.5 mL離心管中，加新開(kāi)的氯仿0.2 mL，輕搖15 s。室溫靜置2 ～3 min 后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。然后取上清無(wú)色水相(約0.6 mL)到離心管(DEPC 處理過(guò))，加等體積異丙醇，室溫下靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。觀察總RNA 在管底的白色沉淀，棄去上清，75%乙醇1.0 mL 洗滌(用DEPC 水新配制)后，4 ℃、7 500 r/min離心5 min。去上清，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5 ～10 min，DEPC 處理水20 ～30 μL加入，中槍打勻，55 ～60 ℃水浴10 min溶解總RNA，測(cè)光密度值。電泳:制備10 g/L瓊脂糖凝膠(Agarose gel，AG)，取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，加1 μL 上樣緩沖液混勻，加樣于凝膠載樣孔中，按5 ～10 V/cm 電壓梯度電泳25 ～30 min 后在紫外透射儀下觀察結(jié)果并照相記錄。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 參照Fermentas 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別以不同患者鼻息肉組織cDNA 為模板，擴(kuò)增Eotaxin-2 基因灰度掃描測(cè)定吸光度值。同樣反應(yīng)條件下，擴(kuò)增β-actin 作為陰性對(duì)照，計(jì)算相對(duì)吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s 表示，采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組鼻息肉組織中Eotaxin-2 mRNA 表達(dá)水平 以β-actin 為參照，β-actin 條帶位于318 bp處，兩組均于124 bp 處出現(xiàn)特異性Eotaxin-2 基因條帶，灰度掃描測(cè)定吸光度，激素治療組Eotaxin-2 mRNA 吸光度值為(0.83 ± 0.09)，未治療組為(2.41 ±0.35)，激素治療組Eotaxin-2 mRNA 明顯低于未治療組(P ＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 Eotaxin-2 mRNA RT-PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 HE 片中EOS 數(shù)量結(jié)果判定 HE 染色切片光鏡下觀察EOS，其胞漿染為粉紅色，細(xì)胞多呈圓形，體積較大，深藍(lán)色分葉或腎形雙核，在250 倍視野下每例標(biāo)本選取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)EOS 細(xì)胞數(shù)，按EOS 細(xì)胞所占的百分率分為- ～+ + + (-:EOS 細(xì)胞≤5%;+:EOS 細(xì)胞占6% ～30%;+ +:EOS 細(xì)胞占31% ～50%;+ + +:EOS 細(xì)胞＞50%)。見(jiàn)表1，圖2、圖3。

表1 激素治療組與未治療組嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況(例，%)

圖2 未治療組鼻息肉組織中EOS 浸潤(rùn)情況(HE 染色×200)

圖3 治療組鼻息肉組織中EOS 浸潤(rùn)情況(HE 染色×200)

3 討論

鼻息肉組織光鏡下表現(xiàn)為大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以EOS 為主，主要位于粘膜下、小血管周圍。武宇宏［3］在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，鼻息肉組織存在大量活化期EOS，表現(xiàn)為包膜不完整且胞漿皺折增多，伸出偽足，偽足內(nèi)可見(jiàn)顆?；蚩张荩鴮?duì)照組EOS 明顯減少，且均為靜息態(tài)EOS。鼻息肉中EOS 增多是Eotaxin 的趨化作用使EOS 發(fā)生選擇性聚集的結(jié)果。Eotaxin 是EOS 的高選擇性趨化因子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的成員有Eotaxin-1、Eotaxin-2、Eotaxin-3。其中，Eotaxin-2 是最主要的趨化因子，特異性趨化EOS，促使其向局部浸潤(rùn)并激活。Schaefer 等［4］發(fā)現(xiàn)，Eotaxin-2 主要存在于鼻腔粘膜內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，表明Eotaxin-2 從粘膜內(nèi)側(cè)遷移到上皮層，引起EOS 為主的炎性反應(yīng)疾病。Eotaxin-2 對(duì)鼻息肉的形成起著很重要的作用。

糖皮質(zhì)激素鼻噴劑輔助治療鼻息肉已廣泛應(yīng)用于臨床，并取得一定療效。2007 年歐洲鼻竇炎/鼻息肉診療指南將鼻噴激素作為治療鼻息肉的A類推薦［5］。王成碩等［6］對(duì)鼻息肉患者采用經(jīng)鼻霧化吸入布地奈德混懸液1 周，視覺(jué)模擬評(píng)分發(fā)現(xiàn)，鼻塞、流涕、嗅覺(jué)喪失、頭痛癥狀均明顯減輕，鼻內(nèi)鏡下見(jiàn)息肉體積明顯減小，且對(duì)腎上腺皮質(zhì)功能無(wú)明顯影響［7］，提示短療程鼻霧化吸入激素治療鼻息肉安全有效。楊武等［8］采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)，全身應(yīng)用激素后，鼻息肉組織中Eotaxin 表達(dá)顯著降低，表明糖皮質(zhì)激素抑制Eotaxin 蛋白的表達(dá)，減少EOS 募集和活化。任秀敏等［9］研究發(fā)現(xiàn)，鼻息肉患者應(yīng)用布地奈德鼻噴霧劑噴鼻治療4 ～6周后，Eotaxin 蛋白在鼻息肉組織中表達(dá)顯著降低。本研究結(jié)果表明，患者應(yīng)用曲安奈德鼻噴霧劑治療6 ～8 周后，鼻息肉較前明顯減小，鼻堵癥狀緩解，鼻粘膜水腫減輕，嗅覺(jué)改善，術(shù)后病理切片顯示，EOS 浸潤(rùn)較治療前明顯減少，且Eotaxin-2 mRNA 的表達(dá)明顯下調(diào)，與上述研究結(jié)果一致。表明鼻噴激素使鼻息肉組織中Eotaxin-2 蛋白的表達(dá)減少，進(jìn)而減少了嗜酸粒細(xì)胞聚集和活化，使鼻息肉組織中的EOS 炎癥反應(yīng)程度降低，提示阻止炎型遞質(zhì)可能是治療鼻息肉的一種新思路。有關(guān)糖皮質(zhì)激素具體抑制Eotaxin 蛋白表達(dá)的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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