王 征，羅 全，玉寒冰

急性肺動脈栓塞(Acute pulmonary embolism，APE)占臨床心血管疾病死亡病因的第3 位，僅次于腫瘤和心肌梗死［1］，是內(nèi)源性或外源性栓子堵塞肺動脈，引起肺循環(huán)及呼吸功能障礙為主的臨床病理生理綜合征，是一種發(fā)病率、誤診率和病死率均高的常見疾病。惡性腫瘤患者更容易發(fā)生APE，尤其在化療及手術(shù)下床后。因此，深入研究和認識急性肺動脈栓塞的病理生理改變和發(fā)生后的肺水平衡變化，可能關(guān)系到APE 救治的成功率。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物:30 只SPF 級SD 大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量250 ～300 g，隨機分為對照組、肺動脈栓塞4 h 組和24 h 組，每組10 只。主要儀器及試劑:ABI PRISM 7000 型熒光定量PCR 儀(Applied Biosysterms，USA);Harvard 683 型小動物呼吸機(USA);RNA 探針和抗體購自Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 急性肺動脈栓塞模型 SD 大鼠稱重及苯巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)臺上。通過大鼠口腔插管(STIV 導(dǎo)管)，右側(cè)臥位，小動物呼吸機輔助通氣，100%氧氣，氣道壓7 cmH2O，呼吸末正壓2 cmH2O，潮氣量2 mL，呼吸次數(shù)70 次/min。體溫控制在(37 ±1)℃，左開胸，輕柔地游離出左肺動脈，以3/0 號絲線結(jié)扎，關(guān)胸前確認左肺再次膨脹起來。對照組:麻醉后氣管插管過程同前，僅行開胸手術(shù)后關(guān)胸，不結(jié)扎左肺動脈。

1.2.2 肺水容量的測量 分別切除雙側(cè)鼠肺并立即秤重(濕肺LW)，然后放于65 ℃的烤箱中，4 d后測量干肺重量(干肺DW)，LW 和DW 的比率計算公式:LW/DL=(LW-DL)/DL。

1.2.3 肺水清除率(AFC)的測量 大鼠麻醉后自然清醒，術(shù)后大鼠自由取食水，分別經(jīng)過4 h、24 h的左肺動脈結(jié)扎后，測量離體的結(jié)扎鼠肺AFC。首先，大鼠腹腔麻醉后(Pentobarbital sodium，50 mg/kg)，腹主動脈放血處死。經(jīng)胸骨正中切開，游離出氣管及雙肺。以等滲的鹽水溶液(37 ℃)含5%小牛血清白蛋白溶液注入結(jié)扎肺(6 mL/kg)后，置鼠肺于37 ℃濕潤的保溫箱內(nèi)，以100%濃度的氧氣、7 cmH2O 氣道壓膨脹1 h 后，分別吸出左肺的肺泡內(nèi)液，注入和吸出的肺泡內(nèi)液的蛋白濃度通過剛果紅蛋白染色方式(SRL INC，TOKYO，JAPAN)測量。通過肺泡腔內(nèi)液增長的蛋白濃度評估AFC，AFC 計算公式:AFC=(Vi-Vf)/Vi×100，Vf=(Vi×Pi)/Pf(Vi 代表注入白蛋白的容積，Vf 代表吸出的蛋白容積;Pi 代表注入白蛋白的濃度，Pf 代表吸出的蛋白濃度)。

1.2.4 觀察Propranolol 和Terbutaline 對結(jié)扎左肺動脈鼠肺的AFC 的影響 分別將等滲的5%的白蛋白溶液含Propranolol(10-4M)和含Terbutaline(10-6M)滴入離體的實驗組大鼠左肺內(nèi)(n=5)。然后測定AFC 組。

1.2.5 Real time PCR 測定 結(jié)扎左肺動脈4 h、24 h 后，大鼠經(jīng)腹腔麻醉后處死，遠端肺組織樣本放入-80 ℃的液氮中冷凍。以RNA 提取劑從肺組織中提取總RNA，在RNA 機中，以3.5 μL 總RNA 合成cDNA。然后包括3.5 μL cDNA，1 μL TaqMan 探針，DEPC 水5.5 μL，10 μL TaqMan PCR MIXTURE 共20 μL 置入PCR 機中，50 ℃持續(xù)2 min，95 ℃持續(xù)10 min，90 ℃15 s，60 ℃持續(xù)1 min，共40 個循環(huán)(ABI PRISM 7700;Applied Biosysterms)。選最低Ct 值為標準樣本。標準曲線基因表達水平以目標基因與GAPDH 的比值確定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0 軟件進行分析，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，兩個變量間的關(guān)系分析采用多因素相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左肺動脈結(jié)扎對肺水平衡影響 左肺動脈結(jié)扎4 h 后，同一只大鼠左肺的濕干比率開始時大于右肺，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);24 h 后，同一只大鼠左肺的濕干比率明顯大于右肺(P ＜0.05)，也大于沒有左肺動脈結(jié)扎的大鼠的左肺;對照組左右肺的濕干比率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 左肺動脈結(jié)扎對肺水平衡的影響(g/g)

2.2 肺動脈結(jié)扎對AFC 的影響及β 腎上腺素激動及抑制劑對結(jié)扎鼠肺AFC 的影響 在同一只結(jié)扎肺動脈4 h 大鼠中，結(jié)扎肺AFC 明顯升高(14.2% ±1.0%，P ＜0.05)，24 h 后左肺的AFC仍然升高，但是較結(jié)扎肺動脈4 h 輕度下降(P ＞0.05)。在全部(4 h 組、24 h 組)結(jié)扎左肺動脈的大鼠中，β 腎上腺素受體激動劑Terbutaline(10-6M)可輕度升高4 h 組結(jié)扎左肺動脈的AFC(P ＞0.05)。24 h 組輕度下降(P ＞0.05)。β 腎上腺素抑制劑Propranolol(10-4M)可以抑制結(jié)扎肺動脈4 h 組大鼠上升的AFC 值(P ＜0.05)，但是在24 h組抑制不明顯。見圖1。

圖1 肺動脈阻塞及β 腎上腺素激動/抑制劑對AFC 的影響

2.3 肺動脈梗阻時左肺β2腎上腺素受體mRNA的測定 Realtime-PCR 結(jié)果表明，4 h 組結(jié)扎肺動脈肺臟β2腎上腺素受體的mRNA 表達水平明顯上升，24 h 組明顯下降。見圖2。

圖2 肺動脈阻塞時左肺β2 腎上腺素受體的mRNA 的變化

2.4 形態(tài)學(xué)檢查 未結(jié)扎左肺動脈的對照組的雙肺和結(jié)扎左動脈的實驗組的雙肺未發(fā)現(xiàn)肺泡內(nèi)的水腫液，在實驗組各亞組的結(jié)扎動脈的肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)有肺泡內(nèi)水腫液、小血管梗死灶和栓子形成。見圖3、圖4。

圖3 未結(jié)扎左肺動脈的雙肺未發(fā)現(xiàn)肺泡內(nèi)的水腫液

圖4 結(jié)扎動脈的肺泡內(nèi)發(fā)現(xiàn)有肺泡內(nèi)水腫液、小血管梗死灶和栓子形成

3 討論

急性肺動脈栓塞極易漏診和誤診，即使在診斷和治療技術(shù)發(fā)達的今天，病死率仍為25% ～30%［2］。臨床上對于其肺臟的分子水平的變換還不十分清楚。本研究通過左肺動脈結(jié)扎模擬急性肺動脈梗塞的病理過程，觀察肺動脈梗塞后急性期24 h 內(nèi)肺臟病理變化過程，探討其發(fā)生原因。肺動脈結(jié)扎4 h 后，結(jié)扎肺的干濕比會輕度上升，但與對側(cè)健肺比較無明顯差別。但結(jié)扎24 h 后，結(jié)扎肺明顯發(fā)生肺水腫，而健肺無異常。這提示左肺動脈結(jié)扎(梗塞)后，明顯影響局部的血液供應(yīng)，造成組織灌流不良，從而發(fā)生缺血缺氧改變，引起肺臟損傷，從而發(fā)生肺水腫，但這種梗阻并不導(dǎo)致健肺的水腫。

關(guān)于肺水腫的發(fā)生機制，美國學(xué)者Matthay 提出了“肺水平衡”［3］理論，即肺臟在受到損傷后，肺臟毛細血管的通透性增強，導(dǎo)致肺間質(zhì)液體量明顯增加，如果進入間質(zhì)的液體量超過承受極限，可能會發(fā)生肺泡內(nèi)液體的集聚。肺泡細胞表面同時具有將多余的水分重新吸收能力，這種轉(zhuǎn)運液體的能力被稱為“肺水清除率”。

AFC 是肺泡對于肺水失衡的調(diào)節(jié)能力，是由很多因素決定的。它的升高代表肺臟調(diào)節(jié)水的能力提高，肺動脈被結(jié)扎或突然栓塞后可以導(dǎo)致局部肺動脈壓的升高，從而導(dǎo)致局部靜水壓的升高。因而可以發(fā)生血管內(nèi)的水分過多地進入到肺泡間質(zhì)甚至進入到肺泡腔內(nèi)，這時自身的調(diào)節(jié)機制增強，所以AFC 快速升高。這種升高在4 h 時即達到高峰，并一直持續(xù)存在，因而保持肺水平衡不會明顯被打亂。但是隨著持續(xù)時間的延長，病因沒有被改善，各種調(diào)節(jié)機制的功能逐漸下降，可能導(dǎo)致AFC 下降，肺水腫的發(fā)生。在本組實驗中觀察24 h 組的變化即證實這種假設(shè)。AFC 升高主要與β 腎上腺素受體相關(guān)［4］，β 腎上腺素受體激活可以調(diào)節(jié)各種水通道轉(zhuǎn)移水的能力明顯加強［5］。

肺動脈結(jié)扎(梗塞)后通過AFC 測定，觀察到在結(jié)扎(梗塞)4 h 后，AFC 明顯增加，到24 h 后有輕度下降。這種增加通過Terbutaline(β 腎上腺素受體激動劑)不能進一步增加，但是可以被propranolol 所抑制。肺血運梗阻后導(dǎo)致的AFC 升高可能通過β 腎上腺素受體被激活。有實驗表明，肺動脈壓力增高可以使肺臟重吸收水分的能力減弱［6］。Realtime PCR 結(jié)果提示，在結(jié)扎(梗阻)4 h后，β2腎上腺素受體mRNA 明顯增加，而到24 h時有所下降。進一步提示β2腎上腺素受體蛋白的合成與AFC 密切相關(guān)。病理切片顯示，在24 h大鼠肺臟出現(xiàn)了明顯的肺泡水腫、小血管梗死灶和栓子，代表水腫已經(jīng)發(fā)生。

本研究提示，在實驗大鼠肺動脈結(jié)扎后，早期會出現(xiàn)肺泡肺水平衡失調(diào)，但是隨著AFC 的調(diào)節(jié)能力的增強，可以有所緩解，但是這種能力有限，當(dāng)結(jié)扎時間延長至24 h，這種主動調(diào)節(jié)能力下降，肺水腫隨之產(chǎn)生。AFC 的上升與β 腎上腺素受體mRNA 過度表達相關(guān)。大鼠肺動脈結(jié)扎后，通過β腎上腺素受體的過度表達升高AFC 來調(diào)節(jié)局部的肺水平衡。

［1］ Torbicki A，Perrier A，Konstantinides S，et al. Guidelines on the diagnosis and management of acute pulmonary embolism:the Task Force for the Diagnosis and Management of Acute Pulmonary Embolism of the European Society of Cardiology(ESC)［J］.Eur Heart J，2008，29(18):2276-2315.

［2］ 賈衛(wèi)濱，張春秀，項志敏.中國肺動脈栓塞誤診近四年文獻分析［J］.中華心血管病雜志，2006，4(3):278-279.

［3］ Matthay MA，Ware LB，Zimmerman GA. The acute respiratory distress syndrome［J］.J Clin Invest，2012，122(8):2731-2740.

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［6］ Gusarova GA，Trejo HE，Dada LA，et al.Hypoxia leads to Na，KATPase downregulation via Ca(2 +)release-activated Ca(2 +)channels and AMPK activation［J］. Mol Cell Biol，2011，31(17):3546-3556.