薛蔚雯 任自敬 焦春紅 曾趙軍

合成致死作用中DNA損傷修復(fù)機(jī)制的研究

薛蔚雯 任自敬 焦春紅 曾趙軍★

合成致死（Synthetic lethality）作用即生物體內(nèi)多個(gè)基因共突變時(shí)，會(huì)造成無(wú)法被機(jī)體本身調(diào)控機(jī)制修復(fù)的DNA損傷，引發(fā)細(xì)胞凋亡。以DNA損傷反應(yīng)與修復(fù)網(wǎng)絡(luò)為背景，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路中關(guān)鍵位點(diǎn)基因的共突變，來(lái)解決腫瘤細(xì)胞治療過(guò)程中的凋亡逃避，為特定基因遺傳背景的腫瘤治療提供了特異性、個(gè)體化的治療方案。三陰性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）通常伴有brca基因缺陷，對(duì)其合成致死作用的發(fā)現(xiàn)和深入研究也為惡性腫瘤治療提供了新的方向。本文針對(duì)目前研究較為透徹的合成致死基因位點(diǎn)的作用原理及意義進(jìn)行概述，包括brca、p53、atm/atr等。同時(shí)討論了合成致死作用在自殺基因系統(tǒng)和藥物化療兩種惡性腫瘤治療方案中可能存在的積極作用。

合成致死；DNA損傷修復(fù)；惡性腫瘤治療

合成致死（Synthetic lethality）作用是指多個(gè)基因同時(shí)突變引發(fā)細(xì)胞凋亡的一種細(xì)胞自身的調(diào)控機(jī)制[1]。值得注意的是，這些基因中的一個(gè)或非全部的幾個(gè)突變將不會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡，而是啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)[2]，而使細(xì)胞免于凋亡[3,4]。1922年合成致死作用在對(duì)果蠅基因組的研究中首次被發(fā)現(xiàn)，Bridges等[5]觀察到pd和pdr雙突變的果蠅不能存活。隨著系統(tǒng)性基因分析法（Systemic genetic analysis，SGA）在以酵母細(xì)胞株基因組為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)中被建立，開(kāi)啟了全基因組合成致死研究的時(shí)代[6]。合成致死作用在生物界中普遍存在，且同一生物個(gè)體中存在的合成致死途徑也不單一。2001年，Simons等[7]首次在人類(lèi)細(xì)胞中對(duì)與藥物合成致死的基因位點(diǎn)進(jìn)行了篩選。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)對(duì)治療特定基因突變背景的癌癥藥物篩選具有指導(dǎo)性意義。合成致死作用若僅視為一種細(xì)胞自身的適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制，必會(huì)被禁錮在理論層面上，其要真正應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療，還需要以成熟的治療手段為依托。本文將著重論述幾個(gè)熱點(diǎn)的合成致死位點(diǎn)及其產(chǎn)生致死作用的原理，并分析它們對(duì)惡性腫瘤臨床治療的意義。

1 BRCA基因缺陷型癌細(xì)胞中PARP1抑制劑的合成致死作用

乳腺癌和卵巢癌的發(fā)病與人類(lèi)乳腺癌易感基因1/2 （Breast cancer susceptibility gene1/2，brca1/brca2）的突變有密切的關(guān)系[8]。brca1/brca2基因功能的喪失會(huì)直接導(dǎo)致無(wú)錯(cuò)同源重組修復(fù)缺失，致使單鏈退火（Single strand annealing，SSA）和非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）等保真性差，易導(dǎo)致突變的修復(fù)途徑介導(dǎo)損傷修復(fù)[9]。brca1突變的HR缺陷型細(xì)胞雖可耐受該基因的突變，但DNA損傷的持續(xù)積累會(huì)使細(xì)胞易惡變?yōu)榘┘?xì)胞。5%~10%的乳腺癌由brca及相關(guān)基因突變引起，為有特定遺傳背景的遺傳性乳腺癌[10]。雖然散發(fā)性乳腺癌中通常檢測(cè)不到brca突變，但其對(duì)應(yīng)的mRNA及蛋白質(zhì)含量較正常細(xì)胞均呈顯著降低趨勢(shì)[11]。

作為重要的抑癌基因產(chǎn)物，BRCA參與多種DNA損傷修復(fù)過(guò)程。特別是在同源重組（Homologous recombination，HR）介導(dǎo)的雙鏈斷裂修復(fù)（Doublestrand break repair，DSBR）中參與方式多樣，作用機(jī)制復(fù)雜。以BRCA1為例：通過(guò)C端BRCT（BRCA1 carboxyl-terminal）磷酸化肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域與磷酸化組蛋白H2AX結(jié)合，進(jìn)而與MDC1（Mediator of DNA damage checkpoint protein 1）和MRN（Mre11，Rad50 and Nbs1）復(fù)合物作用，激活A(yù)TM（Ataxia telangiectasia mutated）/ATR（Ataxia telangiectasia mutated and Rad3 related）等激酶啟動(dòng)DBSR通路，募集下游蛋白集結(jié)[12]；通過(guò)氨基酸殘基與Rad51作用，促進(jìn)同源重組修復(fù)中鏈的交換[13]；通過(guò)N端RING結(jié)構(gòu)域與BARD1（BRCA1-associated RING domain）形成具有E3泛素連接酶活性的穩(wěn)定異二聚體調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的泛素化[14]等。BRCA1在細(xì)胞中以其兩端的BRCT和RING結(jié)構(gòu)域與多種DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生相關(guān)蛋白相作用，如：PALB2（Partner and localizer of BRCA2），BRIP1（BRCA1-interacting protein 1），BACH1（Basic leucine zipper transcription factor 1），TOPBP1（Topoisomerase IIβ binding protein 1）及RAP80（Receptor-associated protein 80）等，其很可能同腳手架蛋白一樣發(fā)揮著連接通路中其他功能蛋白的中繼作用[15]。同時(shí)，編碼BRCT和RING結(jié)構(gòu)域的基因片段也是brca1中最易發(fā)生突變的部分，其突變將導(dǎo)致brca1表達(dá)缺失，這使brca2的穩(wěn)定性也大幅下降[16]。多聚二磷酸核糖腺苷聚合酶1[Poly（ADP-ribose）polymerase 1，parp1]基因是DNA損傷修復(fù)的另一關(guān)鍵位點(diǎn)，該種聚合酶參與包括BER，NER及NHEJ在內(nèi)的多個(gè)修復(fù)途徑，主要作用方式為連接包括自發(fā)性損傷在內(nèi)的各種單鏈斷裂損傷（Single strand break，SSB）并參與其修復(fù)（SSBR）[17]。與此同時(shí)，作為DDB2（Damaged DNA-binding protein 2）的聯(lián)合因子，PARP1在DDB2的影響下負(fù)責(zé)招募染色質(zhì)重塑酶ALC1（Amplif i ed in liver cancer 1），修復(fù)由紫外線引起的DNA交聯(lián)[18]；抑制DDB2自身的泛素化，延長(zhǎng)蛋白存留時(shí)間，使其WD40 重復(fù)結(jié)構(gòu)域發(fā)揮類(lèi)似腳手架蛋白的作用[19]。

在對(duì)有顯著brca缺陷背景的三陰性乳腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，brca與parp1有顯著的合成致死作用。由于BRCA和PARP1均同時(shí)作用于損傷修復(fù)通路中的多個(gè)環(huán)節(jié)，因此對(duì)于這個(gè)現(xiàn)象存在著多種互不排他解釋?zhuān)缙诒粡V泛認(rèn)同的是：PARP1功能的缺失或抑制將造成SSBR缺陷，這時(shí)一旦復(fù)制叉遇到SSBs就會(huì)轉(zhuǎn)化為DSBs途徑進(jìn)行修復(fù)，這種轉(zhuǎn)變開(kāi)始于γ-H2AX和Rad51病灶的產(chǎn)生[20,21]。細(xì)胞中的DSBs主要通過(guò)重組修復(fù)恢復(fù)正確的遺傳信息，這一修復(fù)包括發(fā)生在G1期的NHEJ和在S期末及G2期進(jìn)行的無(wú)錯(cuò)HR。但這種由SSBs轉(zhuǎn)化而成的特殊單一末端DSBs將無(wú)法進(jìn)行主要由Ku70-Ku80異二聚體指導(dǎo)，XLF（XRCC4-like factor）和DNA連接酶Ⅳ參與的NHEJ修復(fù)過(guò)程，只能依賴(lài)于由MRN復(fù)合體和CtIP介導(dǎo)的HR途徑進(jìn)行修復(fù)[22]。有實(shí)驗(yàn)表明在野生型細(xì)胞中加入PARP1抑制劑處理24 h之后不會(huì)發(fā)生顯著地細(xì)胞存活降低[23]，即在HR損傷修復(fù)功能正常時(shí)，SSBs被代償修復(fù)之后細(xì)胞DNA不會(huì)明顯受損。但在brca缺陷型細(xì)胞中，由于該基因的缺失造成HR損傷修復(fù)途徑無(wú)法正常行使功能，SSBs將轉(zhuǎn)化為復(fù)制偶聯(lián)DBSs而大量積累，最終引起細(xì)胞凋亡。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)該作用發(fā)生的主導(dǎo)機(jī)制與PARP抑制劑導(dǎo)致PARP1在DNA修復(fù)過(guò)程中滯留于DNA損傷處，進(jìn)而導(dǎo)致可由BRCA作用解除的復(fù)制叉阻滯，或PARP對(duì)同源重組修復(fù)具有直接的催化作用[24]有關(guān)。但無(wú)論是什么機(jī)制在起作用，PARP抑制劑在brca缺陷型細(xì)胞中合成致死作用的明顯效果已讓人們迫不及待的將這項(xiàng)理論結(jié)果實(shí)踐于臨床。PARP抑制劑在以哺乳類(lèi)模式生物為對(duì)象的試驗(yàn)中已初見(jiàn)成效，但也有研究顯示brca1缺陷型細(xì)胞可能通過(guò)二次突變或刪除、沉默53BP1等方式來(lái)避免與parp合成致死。在53BP1耗竭型細(xì)胞中，RAD51將會(huì)通過(guò)RNF8進(jìn)行非BRCA1依賴(lài)性,不引起RPA（Replication protein A）集結(jié)和磷酸化的損傷應(yīng)答和修復(fù)，這也稱(chēng)為合成存活現(xiàn)象[25]。RNF8抑制劑被認(rèn)為可以在brca突變，53BP1低表達(dá)的癌細(xì)胞中初步消除合成存活現(xiàn)象，但是否會(huì)引起腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)其他旁路機(jī)制還有待研究。PARP抑制劑也可能會(huì)誘導(dǎo)brca2缺陷型細(xì)胞進(jìn)行次級(jí)基因內(nèi)刪除，以產(chǎn)生新的有HR能力的brca2亞型最終獲得對(duì)PARP抑制劑的抗性[26]。針對(duì)這些機(jī)制的研究還在不斷深入的過(guò)程中。

圖1 經(jīng)典的DNA損傷應(yīng)答系統(tǒng)Figure 1 Classic DNA damage response systems

2 p53相關(guān)的合成致死作用

p53是已知最重要的抑癌基因之一，50%~70%的卵巢癌，大腸癌及頭頸癌病例可檢測(cè)出p53的缺失或突變，其穩(wěn)定和活化由翻譯后修飾機(jī)制精確調(diào)控[27]。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，p53在多項(xiàng)細(xì)胞調(diào)節(jié)通路中起著重要作用：受上游激酶系統(tǒng)PI3-kinase/Akt控制其四聚體N端激活結(jié)構(gòu)域，DNA連接結(jié)構(gòu)域和C端四聚體化結(jié)構(gòu)域能通過(guò)轉(zhuǎn)錄活化手段正調(diào)控凋亡相關(guān)基因BAX（BCL-2 associated X protein），PUMA（p53 upregulated modulator of apoptosis）等的表達(dá)及負(fù)調(diào)控抑制凋亡的BCL-2（B-cell lymphoma 2），存活素等作用于凋亡機(jī)制[28,29,30]；對(duì)細(xì)胞的生存壓力變化進(jìn)行應(yīng)答，如：通過(guò)調(diào)控谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX），醛脫氫酶（ALDH）等的表達(dá)對(duì)低水平氧化壓力進(jìn)行反應(yīng)[31]。p53的合成致死主要有賴(lài)于其上調(diào)p21cip1及GADD45表達(dá)，抑制cyclin B/CDK2復(fù)合物作用并造成cyclin E/CDK2復(fù)合物失去磷酸化pRb的能力[32,33]，非磷酸化pRb將保持與E2F結(jié)合，以pRb/E2F復(fù)合物形式穩(wěn)定存在造成細(xì)胞阻滯S期，G2期[34]的DNA損傷檢查調(diào)控，p53磷酸化蛋白質(zhì)的聚集是細(xì)胞阻滯G1期的主要特征。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)由感受器、中介因子、轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和效應(yīng)器四部分構(gòu)成，其中感受器以PIKKs（Phosphatidylinositol-3-kinase like protein kinases）家族為主，包括主要參與DSBs修復(fù)的ATM及參與SSBs修復(fù)的ATR[35]。效應(yīng)器種類(lèi)眾多，本質(zhì)多為激酶類(lèi)功能蛋白，以調(diào)節(jié)CDK的Cdc25家族為代表，其中包括Chk1，Chk2及被p38在下游激活的MK2（MAPKAP-K2）受體激酶。p38MAPK-MK2途徑為細(xì)胞的生存壓力感應(yīng)途徑。毒素侵害，滲透壓改變或受到熱沖擊等可啟動(dòng)p38-MK2途徑，其激活有賴(lài)于經(jīng)典的損傷反應(yīng)途徑ATM-Chk2或ATR-Chk1的活化[36]。經(jīng)典的DNA損傷應(yīng)答系統(tǒng)如圖一。

p53突變細(xì)胞由于檢查點(diǎn)功能缺陷，會(huì)形成DNA損傷的復(fù)制偶聯(lián)擴(kuò)增并不能有效地進(jìn)行受損細(xì)胞的檢查阻滯，這最終會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡變。而在p53突變腫瘤細(xì)胞中對(duì)周期損傷檢查通路中的其他重要位點(diǎn)如atm/atr的表達(dá)進(jìn)行阻斷將達(dá)到理想的合成致死效果。雖然已知干預(yù)ATR-Chk1通路易造成機(jī)制不明的副作用或次生惡變，但Chk2及MK的阻斷均可于p53突變型癌細(xì)胞中引發(fā)合成致死作用[37]，具體可通過(guò)Chk抑制劑處理實(shí)現(xiàn)。

我們課題組前期開(kāi)展了一系列有關(guān)自殺基因系統(tǒng)HSV-tk/GCV作用于p53野生型乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的實(shí)驗(yàn)，希望找出該療法在腫瘤細(xì)胞中的具體殺傷機(jī)制。通過(guò)分析核酸及蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)p53依賴(lài)上調(diào)p21cip1途徑抑制cyclinE/CDK2作用，使腫瘤細(xì)胞周期阻滯S期。說(shuō)明MCF-7細(xì)胞在抵御GCVTP施加的生存壓力時(shí)，p53介導(dǎo)的G1/S周期阻滯是細(xì)胞賴(lài)以生存的重要機(jī)制。目前我們感興趣的是，將自殺基因系統(tǒng)HSV-tk/GCV用于p53缺陷型腫瘤細(xì)胞是否會(huì)如我們預(yù)期的產(chǎn)生理想的合成致死效果，還是會(huì)促使細(xì)胞通過(guò)其他平行的非p53依賴(lài)機(jī)制代償缺陷，出現(xiàn)合成致死的逃避現(xiàn)象。對(duì)自殺基因系統(tǒng)HSV-tk/GCV作用于p53缺陷型腫瘤細(xì)胞引發(fā)的具體分子機(jī)制的研究，將為合成致死作用的深入和惡性腫瘤的臨床治療起到積極作用。

3 錯(cuò)配修復(fù)中的合成致死作用

錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch repair，MMR）是細(xì)胞在DNA復(fù)制階段對(duì)錯(cuò)配堿基進(jìn)行切除，替換的修復(fù)形式。與錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)的功能基因主要有：MLH1，MSH2，MSH6和PMS2[38,39]。一般認(rèn)為這些基因的突變會(huì)導(dǎo)致MMR缺陷型細(xì)胞的產(chǎn)生，這種細(xì)胞的突變率是正常細(xì)胞的100~1000倍。經(jīng)典的MMR途徑中有兩種主要的異二聚體功能蛋白——MutS和MutL。錯(cuò)配修復(fù)的經(jīng)典途徑為：MutS結(jié)合錯(cuò)配位點(diǎn)并募集中介分子MutL，MutS/MutL復(fù)合體以ATP為能量驅(qū)動(dòng)向下游滑動(dòng)，遇到單鏈缺口時(shí)MutS/MutL復(fù)合體便通過(guò)結(jié)合輔助蛋白PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen），RFC（replication factor C）等固定在缺口處并由核酸外切酶EXO1，DNA聚合酶及連接酶相繼作用完成修復(fù)[40,41]。上述復(fù)制偶聯(lián)損傷引起的MMR與由外界藥物和化學(xué)制劑引發(fā)的MMR組成完整的錯(cuò)配修復(fù)。由外界藥物或經(jīng)化學(xué)誘變劑處理的細(xì)胞中MMR途徑的激活伴隨細(xì)胞周期檢測(cè)途徑（如ATM/ATR依賴(lài)型細(xì)胞捕獲）的活化[42]。可見(jiàn)，錯(cuò)配修復(fù)與周期檢查機(jī)制的密切協(xié)作。在MMR缺陷型細(xì)胞中利用Chk抑制劑，CDK抑制劑等阻遏周期檢測(cè)途徑很可能會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞起到可觀的殺傷效果。由PINK1（PTEN-induced putative kinase 1）抑制劑會(huì)引起MMR缺陷型細(xì)胞出現(xiàn)大量氧化性損傷這一現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)MSH2、MSH6或MLH1功能喪失而形成的MMR缺陷細(xì)胞會(huì)因PINK1基因的沉默而發(fā)生合成致死作用。目前有關(guān)MSH2缺陷轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌（MSH2-def i cient metastatic colorectal cancer，MESH）的合成致死研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。通過(guò)對(duì)不同種錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)基因缺陷的細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)它們的致死途徑并不完全相同，如用制斑素和DNAβ聚合酶處理MSH2缺陷型細(xì)胞和MLH1缺陷型細(xì)胞時(shí)凋亡率會(huì)出現(xiàn)顯著差異[43]，更具體的機(jī)制還有待深入研究。

4 合成致死網(wǎng)絡(luò)的研究

合成致死作用的研究以DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)為背景，該系統(tǒng)由眾多分工不同的抑癌基因和癌基因產(chǎn)物構(gòu)成，其中補(bǔ)充功能性的蛋白質(zhì)，如：磷酸化酶，乙?；傅韧晟普麄€(gè)體系。在Masafumi等[44]對(duì)c-Myc過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中合成致死位點(diǎn)的篩選中，得到了49個(gè)可信位點(diǎn)。其中大部分位點(diǎn)的突變或抑制將引起損傷增加并積累，剩余的與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(以組蛋白乙?；癁橹?及轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)等調(diào)控機(jī)制相關(guān)，如TRRAP和BRD4。動(dòng)物活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了潛在的合成致死位點(diǎn)，CSNK1e。這項(xiàng)研究提示我們癌基因與抑癌基因在合成致死作用中都具有重要的意義。Zhenyu Yang等[45]在近期對(duì)兩種酵母的基因群進(jìn)行分析之后，對(duì)合成致死基因網(wǎng)絡(luò)給出結(jié)論：細(xì)胞中各種功能基因形成平行/匯聚的網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)某一組平行通路中的各條路徑發(fā)生不少于一個(gè)的功能基因突變時(shí)，就可能引起合成致死。這使我們開(kāi)始重視合成致死機(jī)制可能存在的規(guī)律性，對(duì)合成致死位點(diǎn)及基于合成致死作用的腫瘤治療藥物的篩選提供了方向。

5 展望

合成致死作用是以DNA損傷反應(yīng)及修復(fù)系統(tǒng)為背景，普遍存在于各類(lèi)生物細(xì)胞中的一種調(diào)控機(jī)制，理論基礎(chǔ)為多個(gè)基因同時(shí)突變或受到損傷時(shí)對(duì)DNA損傷反應(yīng)、修復(fù)過(guò)程會(huì)造成更加全面的阻斷，造成DNA損傷積累而引發(fā)細(xì)胞凋亡。由于DNA損傷反應(yīng)、修復(fù)網(wǎng)絡(luò)的旁路眾多，復(fù)雜性高及調(diào)控的規(guī)律還尚不明確，目前相關(guān)研究還未廣泛實(shí)踐于臨床治療。合成致死作用可針對(duì)特定基因缺陷型，如Rb，p53，BRCA和Myc等缺陷引起的腫瘤開(kāi)展治療，預(yù)期具有針對(duì)性好，副作用小等優(yōu)勢(shì)。我們期待在不久的將來(lái)，合成致死作用將廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療中，幫助人類(lèi)攻克癌癥治療這一難題。

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DNA damage and repair mechanism in the synthetic lethal interactions

XUE Weiwen, REN Zijing, JIAO Chunhong, ZENG Zhaojun★
(Molecular Biology Research Center, School of Biological Science and Technology, Central South University, Hunan, Changsha 410078, China)

Synthetic lethality is a phenomenon that the cell apoptosis generate when correlative mutations of two or more genes happen in one cell. Regarding the network of DNA damage respond and repair as the background, synthetic lethality may provide a feasible proposal to deal with the apoptosis escapement within cancer cells, and will hopefully give a new method for treating DNA repair-defective human cancers. The defect of brca gene leads this phenomenon in triple negative breast cancer, which is a fundament to further this research. In this review, we discuss recent advances including the breast cancer susceptibility gene, p53, atm/atr and so forth. At the same time, we analyse some appearing pathways in posse when the synthetic lethality phenomenon combined with a system of suicide genes or chemotherapeutics.

Synthetic lethality; DNA damage repair; Therapy of carcinoma

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172154）；湖南省大學(xué)生研究性和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)資助項(xiàng)目（BY12071）；中南大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練資助項(xiàng)目（CL11230）

中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心，湖南，長(zhǎng)沙 410078

★通訊作者：曾趙軍，E-mail:zengzj71@sina.com