郭無(wú)瑕,李肖斐

(大連標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)研究中心,遼寧大連116021)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定干海參中硝基呋喃代謝物殘留量

郭無(wú)瑕,李肖斐

(大連標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)研究中心,遼寧大連116021)

建立了檢測(cè)干海參中4種硝基呋喃代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。將干海參樣品經(jīng)過(guò)鹽酸水解,以2-硝基苯甲醛(2-NBA)為衍生劑,經(jīng)HLB固相萃取凈化后,用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ESI+)MRM檢測(cè),同位素內(nèi)標(biāo)定量。結(jié)果表明:4種硝基呋喃代謝物的線性范圍均為0.5～10.0 μg/L,檢出限均為0.5 μg/kg,3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為76.4% ～88.4%。該方法穩(wěn)定性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,能滿足干海參中4種硝基呋喃代謝物殘留檢測(cè)的要求。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;干海參;硝基呋喃代謝物

隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們保健意識(shí)的增強(qiáng),海參的消費(fèi)量急劇增加,而自然養(yǎng)殖海域的極大減少又刺激了海參養(yǎng)殖的快速和無(wú)序發(fā)展,導(dǎo)致其病害不斷發(fā)生。海參養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期施用抗生素,不僅會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體免疫力下降,而且還會(huì)因藥物殘留而危害食用者的健康。硝基呋喃類(lèi)藥物是一類(lèi)合成的抗菌藥物,因其價(jià)格低廉且療效佳,被廣泛用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1]。研究表明,此類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物AOZ、AMOZ、SEM和AHD均可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變和基因突變,對(duì)人的健康造成危害[2]。歐盟和美國(guó)分別在1995、2002年全面禁止將該類(lèi)藥物用于食源性動(dòng)物。中國(guó)也于2002年規(guī)定在所有食用動(dòng)物養(yǎng)殖中禁止使用硝基呋喃類(lèi)藥物[3]。硝基呋喃類(lèi)藥物在生物體內(nèi)代謝迅速,無(wú)法檢測(cè),而其代謝物因與蛋白質(zhì)結(jié)合相對(duì)穩(wěn)定,故主要利用其代謝物檢測(cè)硝基呋喃類(lèi)藥物的殘留狀況[4]。硝基呋喃代謝物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[5]、酶聯(lián)免疫法[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等,目前關(guān)于獸肉、鮮水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物檢測(cè)方法的研究較多[8-10],但關(guān)于干海參中硝基呋喃代謝物檢測(cè)方法的研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中,作者建立了干海參中4種硝基呋喃代謝物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法,并對(duì)樣品處理方法、色譜條件、質(zhì)譜條件等進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)儀器主要有XEVO液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司)、Autogizer均質(zhì)儀(Tomtec公司)、SHA-C恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)、3-30K型冷凍離心機(jī)(Sigma公司)。

試驗(yàn)藥品主要有SEM、AOZ、AHD、AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer公司),SEM-13C-15N、AOZD4、AHD-13C3、AMOZ-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(Witega公司),2-硝基苯甲醛(百靈威科技有限公司),固相萃取柱HLB(Waters公司,3 mL,60 mg)。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純,其余試劑均為分析純。試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取8種標(biāo)準(zhǔn)品,用純甲醇溶解并分別稀釋成100 μg/mL的儲(chǔ)備液。將SEM、AOZ、AHD、AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品溶液用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)的甲醇溶液稀釋成1 μg/mL的混合中間工作溶液;4種內(nèi)標(biāo)溶液用50%的甲醇溶液配制成20 μg/L的混合溶液。

1.2.2 色譜和質(zhì)譜條件色譜條件色譜柱Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm1.7 μm),柱溫為40℃;流動(dòng)相為超純水(含0.1%甲酸)和乙腈(含 0.1%甲酸);梯度洗脫,流速為 0.3 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件電離方式有電噴霧電離(ESI)和正離子模式;霧化氣溫度為200℃,霧化氣流速為800 L/h,反吹氣流速為150 L/h;離子源溫度為150℃,毛細(xì)管電壓為1.5 kV;采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)(表1)。

表1 硝基呋喃代謝物的質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)Tab.1 Parameters of mass spectrometry for detection of nitrofuran metabolites

1.2.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g干海參樣品置于離心管中,加入100 μL 20 μg/L的內(nèi)標(biāo)混合溶液和20 mL 0.2 mol/L的HCl,使溶液中鹽酸的量為0.2 mmol/mL(必要時(shí)用濃鹽酸調(diào)節(jié)),再加入0.5 mL新配制的0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛(2-NBA)溶液,均質(zhì)后于37℃水浴中振蕩過(guò)夜。取出后加入2 mL 0.1 mol/L K2HPO4溶液,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7.4,以12 000 r/min離心3 min。取上清液過(guò)固相萃取柱(HLB),依次用5 mL甲醇、10 mL水活化,當(dāng)樣品全部通過(guò)固相萃取柱后用10 mL水洗滌,用真空泵將柱抽干。用4 mL乙酸乙酯洗脫,收集洗脫液并將其在40℃下用氮?dú)獯蹈?用20%的乙腈溶液溶解并定容至1.0 mL,混勻后過(guò)0.2 μm有機(jī)相濾膜,以備測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

干海參中硝基呋喃代謝物以蛋白結(jié)合物的形態(tài)存在于機(jī)體組織中,只有在酸性條件下通過(guò)水解才能釋放出來(lái)。樣品在酸水解過(guò)程中,溶液的pH值極大地影響水解和衍生效率。部分干海參樣品呈堿性,在加入鹽酸后會(huì)消耗一定量的鹽酸,導(dǎo)致酸度不夠、回收率較低。本試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)溶液中鹽酸的量達(dá)到0.2 mmol/mL時(shí)水解完全、回收率較高。因此,在實(shí)際檢測(cè)中處理呈堿性的海參樣品時(shí)應(yīng)使用濃鹽酸調(diào)節(jié),使溶液中鹽酸量達(dá)到 0.2 mmol/mL,這樣才能使樣品水解完全,重復(fù)性好。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

用色譜柱進(jìn)行分離時(shí)待測(cè)物在3 min內(nèi)全部出峰。分別考察以乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相,對(duì)靈敏度和分離度的影響。結(jié)果表明,采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí),對(duì)4種硝基呋喃代謝物的衍生物有較好的色譜分離和分析靈敏度。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將4種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μg/mL用2-硝基苯甲醛衍生,得到相應(yīng)的衍生溶液。采用流動(dòng)注射方式以0.3 mL/min流速分別將4種硝基呋喃代謝物的衍生物注入離子源。在正離子檢測(cè)方式下分別對(duì)其進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析得到母離子峰,再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(子離子掃描),得到碎片離子信息和二級(jí)質(zhì)譜圖,然后再對(duì)錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使母離子與特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大,確定最佳質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.4 線性范圍和檢出限

分別吸取適量的混合中間工作溶液,用50%甲醇稀釋, 使終濃度為 0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mg/L,并加入100～120 mg/L的內(nèi)標(biāo)混合溶液。以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得到各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回歸方程和相關(guān)系數(shù),結(jié)果呈良好的線性關(guān)系;以噪音響應(yīng)的3倍來(lái)測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢出限,SEM、AOZ、AHD、AMOZ的檢出限均為0.5 mg/kg(表2)。

2.5 檢測(cè)方法的回收率和精密度

取空白干海參樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)試驗(yàn),加標(biāo)濃度分別為 0.5、1.0、4.0 mg/kg,按照“1.2.3”節(jié)中的方法處理樣品后進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得4種硝基呋喃類(lèi)代謝物的平均回收率為76.4% ～88.4%,各組分的回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表2。表明該方法穩(wěn)定性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,能滿足干海參中4種硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留檢測(cè)的要求。

綜上所述,本研究中建立的測(cè)定方法步驟簡(jiǎn)單、回收率高、精密度良好,為干海參中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的檢測(cè)提供了一個(gè)準(zhǔn)確、易操作的科學(xué)方法,為政府執(zhí)法部門(mén)開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控工作提供了有力的技術(shù)支持。

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Determination of antibiotics nitrofuran metabolites in dried sea cucumber by HPLC-MS/MS

GUO Wu-xia,LI Xiao-fei
(Dalian Center of Standard Detection Technology,Dalian 116021,China)

A method for detection of 4 metabolites of antibiotics nitrofuran was developed in dried sea cucumber by HPLC-MS/MS.Samples of the dried sea cucumber were hydrolyzed by hydrochloric acid and derived with 2-nitrobenzaldehyde,was purified by HLB solid-phase extraction,and analyzed by HPLC-MS/MS(ESI+)using multiple reaction monitoring(MRM)in which the quantitative analysis was carried out by isotope internal standard dilution technique.The metabolite levels of antibiotics nitrofuran were shown a good linear relationship over the concentration ranging from 0.5 μg/L to 10.0 μg/L,with the detection limit of 0.5 μg/kg,and average recovery from 76.4%to 88.4%,indicating that the method has strong stability,good reproducibility,and meet the requirements for detection of nitrofuran metabolites in dried sea cucumber.

HPLC-MS/MS;dried sea cucumber;nitrofuran metabolite

TS254.7

A

2013-10-10

國(guó)家質(zhì)檢總局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013QK176)

郭無(wú)瑕(1982-),女,碩士,工程師。E-mail:13591322829@139.com

2095-1388(2013)06-0614-03