李云鵬，趙啟慧，郭鵬康，盧 瀟，虎學(xué)山，娜木日嘎

（黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引 言

野生茄托魯巴姆（Solanum torvum）為茄科茄屬植物，其根系發(fā)達(dá)，吸收水分、養(yǎng)分能力強(qiáng)，植株生長(zhǎng)勢(shì)極強(qiáng)，且抗性強(qiáng)，能同時(shí)抗4種土傳病害：茄子黃萎病、枯萎病、青枯病、根結(jié)線蟲(chóng)病，為茄子保護(hù)地嫁接栽培中最主要的抗病砧木[1－2]。研究表明，野生茄托魯巴姆葉片粗提物對(duì)茄子黃萎病具有較好的室內(nèi)抑菌和盆栽防病效果[3－4]；粗提物對(duì)大蔥菌核病菌、辣椒炭疽病菌、茄子黃萎病菌和黃瓜枯萎病菌4種病原真菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用均較強(qiáng)[5]。

李云鵬[6]對(duì)野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的提取條件做了單因素試驗(yàn)，認(rèn)為在幾種常用較高極性提取溶劑中，1∶1乙醇與丙酮為最佳提取溶劑，如果選擇超聲波提取，提取時(shí)間以0.5h較好，而在幾種提取方式中，超聲波提取表現(xiàn)出較好的提取效果。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)在正交表上安排試驗(yàn)可以使處理具有均勻分散性，以進(jìn)行綜合分析比較，達(dá)到以較少的試驗(yàn)次數(shù)得到最佳結(jié)果的目的[7]，因此，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)植物提取物提取條件進(jìn)行優(yōu)化已成為較常用的方法。然而，目前尚未見(jiàn)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化的相關(guān)報(bào)道。

本文在前人對(duì)野生茄托魯巴姆葉片提取物提取條件研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)設(shè)定提取溶劑、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素的正交試驗(yàn)，進(jìn)行提取物制備，根據(jù)各提取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果，確定提取物抑菌物質(zhì)的提取工藝。對(duì)野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的提取條件進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，可為抑菌物質(zhì)的進(jìn)一步分離純化提供理論依據(jù)，為野生茄托魯巴姆葉片提取物的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，也可為其它植物提取物抑菌物質(zhì)的提取條件研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生茄葉片材料：種植野生茄托魯巴姆（Solanum torvum），當(dāng)試材接近成熟期時(shí)采集葉片，清洗干凈，于干燥箱內(nèi)60℃烘干，粉碎過(guò)40目篩（孔徑0.37mm）備用。

供試菌種：黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumarinum）由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院真菌室提供，在PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后冰箱冷藏保存，臨用前在PDA培養(yǎng)基上活化。

1.2 試驗(yàn)儀器

KQ-250B型超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）、RE-52D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、SYQ.DSX-280A手提式不銹鋼電熱蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、SW-CJ-2G超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取物的制備

稱取粉碎后的植物材料，加入植物干樣重量5倍體積的提取溶劑，以超聲波振蕩提取，雙層定性濾紙抽濾，上清液以相應(yīng)的提取溫度恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。然后以95%乙醇定容至1g（植物干樣）／mL，作為提取物母液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了系統(tǒng)考察野生茄托魯巴姆葉片對(duì)黃瓜枯萎病菌抑菌活性物質(zhì)的提取工藝，根據(jù)前人的單因素研究結(jié)果并參考其他植物提取物提取工藝設(shè)計(jì)，選取提取溶劑（A）、提取 溫度（B）、提取 時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）作為考察因素，各設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。各取野生茄托魯巴姆葉片40g，共9份，精密稱量，隨機(jī)取樣編號(hào)為1～9號(hào)，按每個(gè)試驗(yàn)號(hào)的要求進(jìn)行粗提物的制備。以濃度為40g／L提取液進(jìn)行試驗(yàn)，以提取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌直徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取工藝。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.3 生長(zhǎng)速率法[8]測(cè)定提取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

分別取4mL提取液加入96mL冷卻到50～60℃的滅菌PDA培養(yǎng)基中（提取物濃度為40g／L），混合均勻后倒入直徑為85mm的培養(yǎng)皿中，每處理3次重復(fù)，中央接入直徑為0.722cm的供試菌餅，以95%乙醇為空白對(duì)照（CK）。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃暗培養(yǎng)，觀察菌落大?。ǜ鶕?jù)對(duì)照生長(zhǎng)情況確定測(cè)定時(shí)間），用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算菌落凈生長(zhǎng)量和抑菌直徑及抑菌率：

1.3.4 最佳提取條件下不同濃度提取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)最佳提取條件下提取物的抑菌效果，在最佳提取條件下進(jìn)行提取，并將提取物分別稀釋為濃度0.125、0.25、0.5、0.75、1g／mL（提取物終濃度分別為5、10、20、30、40 g／L），按1.3.3的方法測(cè)定提取物對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用DPS統(tǒng)計(jì)軟件以Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果

由表2可見(jiàn)，RB＞RC＞RA＞RD。由此可知，提取溫度是影響提取效果的重要因素，其次為提取時(shí)間和提取溶劑，影響相對(duì)較小的因素是提取次數(shù)，說(shuō)明野生茄托魯巴姆葉片中的抑菌活性物質(zhì)對(duì)溫度較敏感。由K值和k值可知，A3優(yōu)于A1和A2，B2優(yōu)于B3和B1，C1優(yōu)于C2和C3，D3優(yōu)于D2和D1。因此初步得出，野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的較好提取條件為A3B2C1D3。

將測(cè)得的抑菌直徑進(jìn)行方差分析（表3），結(jié)果表明，A、B、C、D 4個(gè)因素對(duì)提取物的抑菌直徑均有極顯著影響。對(duì)9個(gè)處理進(jìn)行差異顯著性分析，進(jìn)一步證明，A3B2C1D3應(yīng)作為最佳提取條件見(jiàn)表4。

表2 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果Table2 Arrangments and results of orthogonal experiments

表3 抑菌直徑方差分析結(jié)果表Table3 Variance analysis based on the inhibitory diameters of mycelial growth

表4 各個(gè)處理間差異顯著性Table4 Significance analysis of different treatments

綜上所述，得到野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的最佳提取條件為以石油醚為提取溶劑，采用30℃超聲波提取3次，每次提取15min。

2.2 最佳提取條件下提取物的抑菌活性

不同濃度最佳提取條件下提取物的抑菌作用見(jiàn)圖1，由圖1可見(jiàn)，隨著提取物濃度的增加，對(duì)黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)，但濃度為20～40g／L時(shí)不同濃度提取物的抑菌作用相差不大，抑制率均＞70%。

圖1 不同濃度提取物對(duì)黃瓜枯萎病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of extracts from different concentration on Fusarium oxysporumf.sp.cucumarinum

3 討 論

在進(jìn)行植物提取物提取條件研究時(shí)，通常是在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行提取條件優(yōu)化，以確定具體提取物的提取工藝。利用正交試驗(yàn)研究提取物的最佳提取工藝的相關(guān)報(bào)道較多，彭友舜等[9]研究了蘆筍莖中多糖的提取工藝，得到了超聲波輔助提取筍莖多糖的最佳提取條件；楊曉帆等[10]得到了魔芋總生物堿的最佳提取條件為料液比1∶12，乙醇濃度85%，索氏提取4h；馬麗娟等[11]研究表明，從蛇床子中提取抑制黃瓜枯萎菌的活性成分以在室溫下95%乙醇連續(xù)超聲提取3次，每次45min為宜。本試驗(yàn)表明，野生茄托魯巴姆葉片中抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌活性物質(zhì)的最佳提取條件為以石油醚為提取溶劑，采用30℃超聲波提取3次，每次提取15min。其中，提取溶劑的研究結(jié)果與李云鵬[6]對(duì)野生茄托魯巴姆葉片抑制茄子黃萎病菌抑菌物質(zhì)提取條件的單因素研究結(jié)果存在較大差異，可能與使用的靶標(biāo)菌不同有關(guān)，也可能是受提取條件各因子間互作效應(yīng)的影響。

本文以黃瓜枯萎病菌為供試菌種，研究了野生茄托魯巴姆葉片抑菌活性物質(zhì)的提取條件，由于同一提取物對(duì)不同病原真菌的抑菌效果可能不同[12]，即抑制一種病原真菌的抑菌活性物質(zhì)可能對(duì)另一種病原真菌沒(méi)有抑制作用。所以本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)其它植物病原真菌是否同樣適用，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)表明，野生茄托魯巴姆葉片的石油醚提取物中具有較強(qiáng)抑制黃瓜枯萎病菌的抑菌活性物質(zhì)，可據(jù)此對(duì)提取物抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，以期獲得抑菌物質(zhì)純品，同時(shí)可進(jìn)行野生茄托魯巴姆葉片石油醚提取物抑制黃瓜枯萎病的盆栽試驗(yàn)，以期為該提取物的應(yīng)用提供更確鑿的依據(jù)。

[1]杜曉榮，潘紹坤.野生茄托魯巴姆成都地區(qū)露地繁種技術(shù) [J].長(zhǎng)江蔬菜，2008，（8）：33-34.

[2]徐本美，孫運(yùn)濤，駱 明，等.茄子砧木——托魯巴姆種子催芽劑的研究 [J].種子，2001，（4）：77-78.

[3]李之璞，周寶利，李云鵬.利用野生茄提取物控制栽培茄子黃萎病的研究 [J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，（2）：34-35.

[4]李云鵬，周寶利，李之璞，等.野生抗病茄植株腐解物對(duì)茄子黃萎病的調(diào)控研究 [J].植物保護(hù)，2007，33（3）：50-52.

[5]李云鵬，尹玉玲，趙 宏，等.野生茄托魯巴姆葉片提取物對(duì)園藝作物病原真菌的抑菌活性 [J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（4）：120-124.

[6]李云鵬.野生茄對(duì)茄子黃萎病菌的化感作用及利用研究 [M].哈爾濱：黑龍江大學(xué)出版社，2009：40-49，53.

[7]鄧振偉，于 萍，陳 玲.SPSS軟件在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果分析中的應(yīng)用 [J].電腦學(xué)習(xí)，2009，（5）：15-17.

[8]方中達(dá).植病研究方法 [M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：151-154.

[9]彭友舜，宋士濤，廉 琪，等.超聲波輔助提取蘆筍莖中多糖工藝的優(yōu)化 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：2645-2646.

[10]楊曉帆，王 紅，王 芳，等.魔芋總生物堿量的測(cè)定 [J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（1）：153-156.

[11]馬麗娟，周寶利，張淑紅，等.蛇床子提取物對(duì)黃瓜枯萎病菌抑制效果的研究 [J].植物保護(hù)，2008，34（4）：36-39.

[12]Qasem J R and Abu-blan.Antifungal activity of aqueous extracrs from some common weed species [J].Application Biology，1996，128：533-540.