葛菲菲，劉 健，楊德全，鞠厚斌，周錦萍

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是危害養(yǎng)禽業(yè)和人類健康的重要病原，已發(fā)現(xiàn)有16個血凝素（hemagglutinin，HA）亞型[1]和10個神經(jīng)氨酸酶（neurominidase，NA）亞型。H9N2亞型禽流感病毒最早于1966年從火雞體內(nèi)分離到[2]，雖然表現(xiàn)低致病性，但由于傳播廣泛、能造成免疫抑制并使宿主容易發(fā)生繼發(fā)感染，特別是可導(dǎo)致雞群產(chǎn)蛋下降或完全停止，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，其危害不容忽視。H9N2亞型禽流感病毒的進化與變異不僅會給目前禽流感的防制帶來困難，而且還有傳染給人的潛在威脅，因此，加強H9N2亞型禽流感病毒變異株的監(jiān)測和防控措施研究具有重要的現(xiàn)實意義。近年來，H9N2亞型禽流感的流行變得日益頻繁，病毒也進入了一個快速進化階段，有可能進一步發(fā)生遺傳變異而進化出致病力更強的毒株，或是受體結(jié)合位點的突變導(dǎo)致出現(xiàn)具有能結(jié)合人和哺乳動物流感病毒受體的特性，或者抗原性變異后導(dǎo)致免疫失敗現(xiàn)象發(fā)生[3-5]。本研究對2012年分離自上海地區(qū)三個發(fā)病雞群的3株H9N2亞型AIV進行了全基因測序，以闡明發(fā)病雞群中H9N2亞型禽流感病毒分離株的遺傳變異及分子特征。為更好地了解近年來中國H9N2亞型禽流感病毒毒力變化和抗原性變異的特點及可能的機理，并為該病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 引物和雞胚A型禽流感病毒通用熒光RT-PCR檢測試劑盒，H5亞型和H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒，以及新城疫病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒均購自深圳匹基生物工程有限公司；雞傳染性支氣管炎病毒引物序列根據(jù)國標GB/T 23197-2008雞傳染性支氣管炎診斷技術(shù)合成；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；新城疫陽性血清、禽流感血凝素分型血清（H5、H9）由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；AMV反轉(zhuǎn)錄酶等試劑均購自寶生物（大連）工程公司；針對H9亞型禽流感病毒8個基因片段HA、NA、M、NS、NP、PA、PB1、PB2基因分別設(shè)計了相關(guān)引物，由于PA、PB1和PB2基因片段較長，所以分成兩段進行擴增，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，具體見表1。

1.2 發(fā)病雞群2012年1月和2月上海地區(qū)三個發(fā)病雞群臨床癥狀主要為咳嗽，張口呼吸，眼瞼腫脹，部分雞有下痢現(xiàn)象，已用抗生素治療，未見明顯效果；病變部位也主要集中在呼吸道器官:氣管充血、出血，氣囊炎，肺實變、淤血、壞死；部分病死雞腳鱗出血，肌胃、腺胃交界處有出血點，脾臟出血，其他臟器、消化道等未見明顯異常。

1.3 病毒的初步鑒定采集病死雞的氣管、肺、腦和腎臟等內(nèi)臟研磨，提取核酸，進行了禽流感病毒、新城疫病毒以及雞傳染性支氣管炎病毒的檢測，并同時進行了細菌分離。結(jié)果為H9亞型禽流感病毒陽性。將H9陽性樣品處理后接種雞胚尿囊腔，將分離毒尿囊液應(yīng)用β-微量法進行HA試驗，以檢測其血凝性及HA效價。根據(jù)HA試驗中所測得的HA效價，將分離毒尿囊液配制成4單位的溶液，分別用新城疫陽性血清，禽流感H5和H9陽性血清進行HI試驗，以檢測該分離物的血凝性是否能被禽流感H9陽性血清所抑制，詳細步驟按照GB/T 18936-2003 高致病性禽流感診斷技術(shù)。

1.4 病毒全基因的RT-PCR擴增用病毒RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，具體步驟按照說明書進行。RT-PCR產(chǎn)物電泳經(jīng)凝膠回收后，按pMD18-T載體說明書進行連接、轉(zhuǎn)化，用EcoRI和HindIII進行雙酶切鑒定；鑒定為陽性克隆后送英駿生物有限公司測序。

1.5 基因cDNA核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析比較借助 DNAStar 4.0 分析軟件 ,通過 Jotun Hein方法分析比較所得序列的同源性以及一些關(guān)鍵位點的變化情況。

1.6 遺傳進化分析借助MEGA3.1分析軟件，確定8個基因片段的遺傳分類情況。

表1 引物序列和目的片段長度Table 1 The primers sequences and the length of PCR products

2 結(jié)果

2.1 病毒的初步鑒定結(jié)果經(jīng)實驗室檢查、細菌分離陰性，結(jié)果鑒定為H9亞型禽流感病毒陽性。從上述三個發(fā)病雞群分離、鑒定的禽流感病毒分別命名為A/chicken/ Shanghai / C1 /2012、A/chicken/ Shanghai/C2/2012、A/chicken/ Shanghai/C3/ 2012， 所 分 離 的3株病毒感染的雞胚尿囊液血凝性能夠被H9型陽性血清所抑制，而不能被H5型陽性血清所抑制，表明這3株病毒均為H9亞型，NA基因經(jīng)測序后，表明這3株病毒為H9N2亞型。

2.2 cDNA全序列同源性比較以及關(guān)鍵位點的分析這3株H9N2亞型禽流感病毒的全基因序列在GenBank的登錄號為KC417046～KC417069。3株H9亞型AIV的HA基因cDNA全序列，均為1683 bp，沒有核苷酸的插入和缺失，核苷酸序列同源性為99.1%～99.2%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為99.1%～99.3%。裂解位點序列分析發(fā)現(xiàn)，所有毒株均為RSSR↓GLF，對禽類為低致病力。對3株毒株的一些關(guān)鍵位點進行分析并與以往從上海地區(qū)健康雞群中分離的4株H9N2毒株進行了比較[6]，這4株H9N2病毒分別是Ck/SH /Y1/02（Genbank NO.GQ335466）、Ck/SH /Y1/06 （Genbank NO.GQ335474）、Ck/SH /Y2/07 （Genbank NO.GQ335498）、Ck/SH /Y1/08 （Genbank NO.GQ335506），上述所有毒株受體結(jié)合位點的右緣均相同，為GTSKA（位于HA的aa146～aa150）；與以往分離的4株毒株相比，本研究中3株毒株的HA基因因220位氨基酸的的變異而缺失一個糖基化位點，受體結(jié)合位點的左緣235位發(fā)生了變異，由Q突變成了M。此外，對公認的抗原位點進行了分析[7]，表2所示:從HA基因抗原位點的分析，與疫苗株Ck/SD/6/96相比，這3株H9N2亞型禽流感病毒7個抗原位點中已有4個發(fā)生了改變；與2002年～2008年期間分離的4株H9N2毒株相比，這3株病毒和07年的分離株抗原位點相同。

表2 抗原位點的分析Table 2 The analysis of antigenic sites

2.3 株分離株的8個基因片段的遺傳發(fā)生關(guān)系從本研究建立的H9N2亞型禽流感病毒8個基因系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)（圖1），上海地區(qū)分離的這3個毒株均屬于Ck/Bei/1/94系，與目前在上海使用的疫苗株Ck/SD/6/96同屬于一個譜系。各片段所屬基因型如表3所示。這3株毒株的8個基因片段所屬基因型相同，他們與08年的分離株Ck/SH /Y1/08 8個基因片段所屬基因型相同。

圖1 2012年上海地區(qū)發(fā)病雞群中H9N2亞型AIV HA、NA、NP、NS、M、PA、PB1、PB2基因進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the HA, NA, NP, NS, M, PA, PB1, PB2 genes of the H9N2 subtype Avian infl uenza viruses from diseased chicken fl ocks in Shanghai area in 2012

表3 H9亞型不同基因的基因分型結(jié)果比較Table 3 Comparison of the genotypes of different segments from H9 subtype Avian infl uenza virus

3 討論

本研究主要針對發(fā)病雞群中分離的H9N2亞型禽流感病毒進行基因進化研究，從分子水平了解其抗原變異和致病力。HA糖蛋白是A 型流感病毒主要表面抗原和保護性抗原，HA糖蛋白的抗原特性直接影響病毒的感染性、致病性、宿主特異性及組織嗜性。但HA基因變異頻率很高，不同位點，尤其是重要氨基酸位點的變異能導(dǎo)致禽流感病毒的抗原性和致病性變異。HA蛋白潛在的糖基化位點也是影響禽流感病毒致病力的重要因素，受體結(jié)合位點附近的糖基會影響病毒和宿主細胞的結(jié)合水平，裂解位點附近的糖基可能通過干擾蛋白酶進入裂解位點影響蛋白酶對HA前體蛋白的裂解。大部分文獻報道，HA蛋白潛在的糖基化位點的出現(xiàn)和增加會使病毒株的毒力下降，而本研究中從發(fā)病雞群分離的3株H9N2毒株，與以往我們從健康雞群中分離的H9N2禽流感毒株相比[6]，因220位氨基酸的變異而缺失一個糖基化位點，受體結(jié)合位點的左緣235位發(fā)生了變異，由Q突變成了M。上述位點的改變是否影響病毒的致病性，宿主特異性以及抗原性，有待于進一步研究。此外也有文獻報道[8]，H9N2亞型AIV變異株HA蛋白在145～147位氨基酸出現(xiàn)1個新的潛在糖基化位點，但同時表現(xiàn)為毒力增強，糖基化位點在序列上所處的位置可能是導(dǎo)致這一差異的原因，因為該糖基化位點剛好處于發(fā)生漂變的關(guān)鍵氨基酸位點上，當然，其中的確切機制和相關(guān)性尚有待研究。此外，通過對HA基因上已公布的7個抗原位點進行分析表明，臨床上分離的毒株與使用的疫苗株相比，部分位點已發(fā)生變異，所以目前使用的疫苗能否給禽群提供足夠的保護力還需要作進一步的研究。本研究中的3株毒株均為重組體，均屬于Ck/Bei/1/94系，這3株病毒與Ck/SH / Y1 / 08 8個基因片段均屬于同一個基因群。隨著時間的推移，Qa/HK/G1/97的基因片段在H9N2亞型禽流感病毒內(nèi)部基因片段重排中出現(xiàn)的頻率增加了。綜上所述，在今后的工作中加強H9N2亞型禽流感流行病學(xué)監(jiān)測是非常必要的。

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