張 雯 杜鵬程 王海印 于偉文 張媛媛 陳 晨*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所生物信息室，北京 102206）

腸桿菌科菌株基因組水平上的遺傳差異（ANI）及其在菌種鑒定上的應(yīng)用

張 雯 杜鵬程 王海印 于偉文 張媛媛 陳 晨*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所生物信息室，北京 102206）

本研究探討了高通量測(cè)序方法在腸桿菌科菌種鑒定中直接應(yīng)用的可能性，第一次提出并驗(yàn)證了基因組平均遺傳相似度(ANI)指標(biāo)在腸桿菌科鑒定中的有效性，為該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供了數(shù)據(jù)積累。

腸桿菌；基因組；ANI；菌種鑒定

腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌是與人類關(guān)系最為密切的一類細(xì)菌，廣泛分布于人與動(dòng)物的糞便、水、土壤和腐物中，包含多種重要的腸道致病菌，如痢疾桿菌和致病性大腸桿菌等。腸桿菌科菌具有一些共同的特征：革蘭染色陰性，桿狀，無(wú)芽孢等，并基于此發(fā)展出一系列檢測(cè)方法（分類培養(yǎng)+生化反應(yīng)+血清分型+毒力試驗(yàn)）。傳統(tǒng)方法檢測(cè)需經(jīng)富集培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察、生理生化反應(yīng)、血清學(xué)鑒定以及必要的動(dòng)物試驗(yàn)等過(guò)程，步驟繁瑣費(fèi)時(shí)，一般7d才能獲得較確切的結(jié)果，難以及時(shí)指導(dǎo)疾病的治療。另外，對(duì)于難以培養(yǎng)的，或者生化反應(yīng)差異模糊的，種系發(fā)生關(guān)系密切的近緣物種（如大腸埃希氏菌和志賀氏菌），很難依靠這些方法鑒定[1]。

表1 腸桿菌科15個(gè)屬的ANI值列表

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)腸桿菌科細(xì)菌分子鑒定的技術(shù)逐漸成熟。典型的技術(shù)手段如16S rDNA/MLST[2]。相對(duì)于傳統(tǒng)鑒別方法，分子檢測(cè)具備靈敏度高、檢測(cè)快捷的優(yōu)點(diǎn)，既可用于分離的細(xì)菌，也可直接用于糞便、食物或環(huán)境水樣品等的快速檢測(cè)，但存在自動(dòng)化程度低、一次檢測(cè)信息量有限、難以實(shí)現(xiàn)高通量篩檢、對(duì)未知來(lái)源或新出現(xiàn)的菌株鑒定難度大等不足[3]。發(fā)展中的高通量測(cè)序技術(shù)正可以彌補(bǔ)這些不足。

近年來(lái)隨著454、Illumina、Solid等第二代高通量測(cè)序技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，已有越來(lái)越多的微生物基因組完成測(cè)序。截止2012年10月，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（以下簡(jiǎn)稱NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有1183個(gè)細(xì)菌全基因組序列。通過(guò)對(duì)以上細(xì)菌進(jìn)行比較基因組學(xué)研究，可以從基因組水平研究細(xì)菌進(jìn)化的機(jī)制，為細(xì)菌分類、分型提供依據(jù)[4]。已完成的對(duì)部分細(xì)菌的比較基因組學(xué)研究表明，每個(gè)分類群僅有10%～20%的基因是特異的，在其他種類中沒有同源基因[1]。因此，通過(guò)對(duì)腸桿菌科的所有基因進(jìn)行比較分析，可以探索直接利用高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行菌種鑒定的方法的可能性，同時(shí)也可以從中找出新的鑒定候選位點(diǎn)，進(jìn)一步提高菌種鑒定的可靠性。

1 材料與方法

1.1 腸桿菌科基因組序列的獲得

本文選用了包括大腸桿菌、鼠疫桿菌、志賀氏菌等在內(nèi)的已有全基因組序列的102株細(xì)菌（15屬，36種），從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp∶//ftp. ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria）下載了其全基因組序列及注釋文件。

1.2 全基因組比對(duì)并計(jì)算ANI（Average Nucleotide Identity）

使用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，version 2.2.17）[5]對(duì)102個(gè)菌株的基因序列進(jìn)行兩兩比對(duì)比對(duì)，篩選掉序列相似性60%以下或者比對(duì)序列比例70%以下的基因。對(duì)于擁有多條比對(duì)結(jié)果的基因，僅考慮其相似性最高的比對(duì)結(jié)果?；蚪M比對(duì)結(jié)果中，比對(duì)序列的總長(zhǎng)度為L(zhǎng)，比對(duì)序列中完全相同的位點(diǎn)總數(shù)為I，則兩菌株的Average Nucleotide Identity (ANI)=I/L[6]。

2 結(jié) 果

在本文中，通過(guò)對(duì)腸桿菌科15個(gè)屬（其余各屬不包含測(cè)序菌株）36種102株細(xì)菌進(jìn)行基因組兩兩比對(duì)（表1）。結(jié)果顯示，除埃希氏菌屬和志賀氏菌屬外，腸桿菌科同一屬內(nèi)的菌株間的ANI值都高于不同屬間的ANI值（圖1）。以耶爾森氏菌屬（Yersinia）為例，13株耶爾森氏菌間的平均ANI值為0.96，顯著高于其他14個(gè)屬比對(duì)的ANI值（P＜0.05，表1）。相同的情況也存在于其他12個(gè)屬。

由此可見，菌株間ANI值可作為基因組水平遺傳差異水平的標(biāo)志，直接反應(yīng)兩者之間的親緣關(guān)系，ANI值越高，親緣關(guān)系越近；反之，ANI值越低，則序列差異越大，基因差異較多，菌株的表型和生化特征也會(huì)有較大差異。

圖1 腸桿菌科15個(gè)屬的ANI值

3 討 論

目前，微生物全基因組測(cè)序雖然已在實(shí)驗(yàn)室領(lǐng)域是較成熟的技術(shù)，但高通量測(cè)序在臨床中直接應(yīng)用到菌種的鑒定分型中還不多。本研究探討了高通量測(cè)序方法在腸桿菌科菌種鑒定中直接應(yīng)用的可能性，第一次提出并驗(yàn)證了ANI指標(biāo)在腸桿菌科鑒定中的有效性，為該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供了數(shù)據(jù)積累。

[1] 杜鵬程,張?chǎng)?劉翟,等.基于同源基因的病原菌鑒定和 分型靶位點(diǎn)的功能基因組學(xué)研究[J].中國(guó)科學(xué),20111,41(9)∶640-648.

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R446.5

B

1671-8194（2013）13-0067-02

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（課題編號(hào)81201322）和艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治重大專項(xiàng)（課題編號(hào)2013ZX10003006-002）資助

*通訊作者：E-mail:chenchen@icdc.cn