劉新穎，汪志平，于金鑫，呂蓓芬，馬麗芳，陳子元

浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)部核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310029

微藻因光合效率高、生長(zhǎng)周期短、脂質(zhì)產(chǎn)率高、不占用耕地，且可高效利用多種污水和廢氣，而被國(guó)內(nèi)外公認(rèn)為第三代生物液體燃料的主要生產(chǎn)者之一，并可望通過發(fā)揮其超強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化功能最終實(shí)現(xiàn)環(huán)境與能源相和諧[1-3]。布朗葡萄藻Botryococcus braunii 因其脂質(zhì)含量高(可達(dá)細(xì)胞干重85%)，而被國(guó)內(nèi)外視為具重大研究與開發(fā)前景的能源微藻之一[4-5]。與其他能源微藻一樣，建立快速、微量、可靠的脂質(zhì)含量檢測(cè)技術(shù)是開展葡萄藻種質(zhì)改良和培養(yǎng)模式優(yōu)化等研發(fā)的基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外普遍采用尼羅紅熒光光譜法快速檢測(cè)微藻等生物細(xì)胞中的脂質(zhì)含量，其主要原理是當(dāng)親脂性的噁嗪類染料——尼羅紅(9-(diethylamino) benzo[a]phenoxazin-5(5H)-one)

進(jìn)入細(xì)胞后能與胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合并發(fā)出熒光，進(jìn)而通過測(cè)定熒光強(qiáng)度即可表征被測(cè)樣品的脂質(zhì)含量[6-8]。該方法的原理與步驟雖簡(jiǎn)單，但必須針對(duì)被測(cè)生物樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)等特殊性解決以下兩方面的關(guān)鍵前提問題才可能奏效。一方面，綠藻等生物堅(jiān)厚的細(xì)胞壁會(huì)阻礙尼羅紅進(jìn)入細(xì)胞，而胞內(nèi)尼羅紅的量不足必然會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低、測(cè)量值偏小[9]。近年來，Chen 等[9]研究發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜能有效輔助尼羅紅進(jìn)入普通小球藻細(xì)胞。隨后，一些學(xué)者通過優(yōu)化二甲基亞砜濃度等條件，有效解決了尼羅紅不易進(jìn)入微擬球藻[10]、單針藻[11]、斜生柵藻[12]、小球藻[13]、細(xì)菌[14]及酵母菌[15]等細(xì)胞的難題。另一方面，分光光度法測(cè)量要求被測(cè)樣品呈溶液或均勻懸浮液[16]，但葡萄藻等一些微藻，其細(xì)胞不同于小球藻和微擬球藻等微藻呈分散狀態(tài)，而是通常呈簇狀或集落態(tài)，這導(dǎo)致藻細(xì)胞不能均勻分布于檢測(cè)液中而嚴(yán)重影響測(cè)量[4]。Lee 等[17]雖于1998年就曾報(bào)道可利用尼羅紅熒光光譜法檢測(cè)葡萄藻的脂質(zhì)含量，但也許因未能有效解決上述兩方面關(guān)鍵問題，致使該方法至今尚未在葡萄藻研發(fā)中得以廣泛應(yīng)用，而仍多沿用樣品用量大、前處理復(fù)雜、耗時(shí)耗力的稱重測(cè)量法[18-19]。

為此，本文擬通過超聲波技術(shù)分散葡萄藻集落、二甲基亞砜輔助尼羅紅進(jìn)入藻細(xì)胞、優(yōu)化染色條件等，有效改進(jìn)現(xiàn)有的尼羅紅熒光光譜法檢測(cè)布朗葡萄藻脂質(zhì)含量的方法，以期為葡萄藻育種與培養(yǎng)等研發(fā)提供快速、靈敏的脂質(zhì)含量檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 藻株與培養(yǎng)條件

B.braunii ZJU3001為本實(shí)驗(yàn)室2003年從云南撫仙湖分離并純化。采用BG-11培養(yǎng)基[20]培養(yǎng)，接種時(shí)藻液的初始OD560為0.1。培養(yǎng)溫度為25℃，光暗周期比12 h∶12 h，光照強(qiáng)度60μmol/(m2·s)，藻液每天搖勻2～3次。試樣均采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液。藻細(xì)胞干重參照黃峙等[21]方法測(cè)定。

1.2 超聲波處理

取4 mL葡萄藻液轉(zhuǎn)入5 mL離心管并置于冰水浴中，設(shè)定JY92-Ⅱ型超聲儀(新芝，中國(guó))的頻率為20 kHz，發(fā)射功率為100 W，變幅桿伸至藻液面下1 cm，以1 s/1 s (開/關(guān))間歇處理藻液20 s。

1.3 光譜檢測(cè)

參照Wang 等[22]方法，用Ultrospec 2000型紫外?可見分光光度計(jì)(Pharmacia 公司，美國(guó))檢測(cè)樣品在400～750 nm 的吸收光譜，其中OD560可反映藻液的藻細(xì)胞密度；參照Lee 等[17]方法，用RF-5000型熒光分光光度計(jì)(Shimadzu 公司，日本)檢測(cè)經(jīng)尼羅紅(NR)染色樣品的熒光發(fā)射光譜。將樣品置于黑體微量比色皿中，使在490 nm 激發(fā)光下掃描500～700 nm 的熒光發(fā)射光譜，并將在540～628 nm 范圍內(nèi)獲得一個(gè)特征性的發(fā)射峰，其峰值可反映藻液的脂質(zhì)熒光強(qiáng)度[9]。

1.4 尼羅紅染色條件的優(yōu)化

[9-13,23]，設(shè)定DMSO 終體積分?jǐn)?shù)、NR 終質(zhì)量濃度以及染色時(shí)間和溫度的優(yōu)化范圍，并依次進(jìn)行優(yōu)化。不同濃度的DMSO 溶液和NR 溶液分別由去離子水稀釋DMSO (分析純)和10μg/mL NR (Sigma 公司)丙酮儲(chǔ)液配制而成。脂質(zhì)檢測(cè)方法為：將葡萄藻液先按1.2方法進(jìn)行超聲波處理，而后依次加入等體積不同濃度的DMSO 溶液和NR 溶液，充分混勻后置于黑暗的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行一定溫度和時(shí)間的染色反應(yīng)，再按1.3方法檢測(cè)其熒光發(fā)射光譜。藻細(xì)胞脂質(zhì)的相對(duì)熒光強(qiáng)度值為染色液的相對(duì)熒光強(qiáng)度值分別減去NR與DMSO混合液及藻液在相應(yīng)波長(zhǎng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度值。數(shù)據(jù)采用SAS 等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄藻光譜檢測(cè)樣品的制備

在自然條件下，葡萄藻細(xì)胞通常聚集成簇，由幾十至上百個(gè)細(xì)胞組成串狀集落，因此藻細(xì)胞在培養(yǎng)液中的分散度和均勻性不佳(圖1，A-1)，影響了光譜檢測(cè)的靈敏度和穩(wěn)定性[15]。我們經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，用頻率為20 kHz、發(fā)射功率為100 W 的超聲波，1 s/1 s (開/關(guān))間歇處理藻液20 s 能有效分散集落，使細(xì)胞呈均勻分布(圖1，A-2)。處理后藻液的可見光吸收值增大了近1倍，680 nm 附近的葉綠素吸收峰更加明顯；因處理前、后藻液上清液的吸光值均幾乎為零，說明并未因超聲使細(xì)胞破碎進(jìn)而導(dǎo)致葉綠素等色素滲漏到藻液而產(chǎn)生相應(yīng)的吸收峰(圖1B)。同時(shí)，由OD560的時(shí)間驅(qū)動(dòng)掃描曲線(圖1C)可知，未經(jīng)超聲波處理的藻液因細(xì)胞呈集落狀、易下沉而導(dǎo)致OD560從樣品放入檢測(cè)池即開始明顯波動(dòng)，約40 s 后呈線性下降，至第5 min 時(shí)已只有原來起初的1/3左右；而處理后藻液的OD560能在2 min 內(nèi)保持穩(wěn)定，至第5 min 時(shí)也仍基本保持不變。對(duì)超聲波處理前、后藻液細(xì)胞干重與OD560的回歸分析結(jié)果(圖1D)顯示，處理組具有更好的重復(fù)性，且檢測(cè)靈敏度比對(duì)照組的提高了52.7%，相關(guān)性系數(shù)也由0.988提高到0.998。以上結(jié)果表明，合適的超聲波處理?xiàng)l件不僅能夠保持葡萄藻細(xì)胞的完整性，而且能有效分散集落細(xì)胞，使藻細(xì)胞在溶液中得以均勻懸浮，滿足了光譜檢測(cè)的要求，這為葡萄藻生物量和脂質(zhì)含量的光譜法測(cè)量打下了基礎(chǔ)。

圖1 超聲波處理對(duì)藻細(xì)胞狀態(tài)及光譜檢測(cè)的影響Fig.1 Effects of ultrasonic treatment on the cell states and spectrum detection.(A) Cell states.(B) Visible spectra.(C)Time driving scanning spectra at 560 nm.(D) Regression curves of dry weight and OD560 of algal samples.1:algal suspension without ultrasonic treatment;2:algal suspension with ultrasonic treatment;3:algal supernatant without ultrasonic treatment;4:algal supernatant with ultrasonic treatment.

2.2 二甲基亞砜對(duì)尼羅紅染色的輔助作用

適當(dāng)濃度的DMSO可輔助NR進(jìn)入藻細(xì)胞進(jìn)而提高脂質(zhì)檢測(cè)的靈敏度，但其適宜濃度因藻種差異而從1%到30%不等[9-13,23]。實(shí)驗(yàn)考察了DMSO 終體積分?jǐn)?shù)分別為0、2%、5%、8%、15%、22%、28%時(shí)對(duì)葡萄藻脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響，其他條件為：NR 終濃度為1.3μg/mL，40℃染色10 min。熒光發(fā)射光譜顯示(圖2)，B.braunii ZJU3001的脂熒光發(fā)射峰出現(xiàn)在568 nm 附近。隨著DMSO 濃度的提高，脂發(fā)射熒光先增強(qiáng)后減弱，當(dāng)DMSO 為5%時(shí)熒光值最大，比不加時(shí)提高了67.4%。值得注意的是，當(dāng)DMSO 濃度過高(終濃度大于15%)時(shí)，不僅脂發(fā)射熒光強(qiáng)度減弱，而且在640 nm 附近會(huì)出現(xiàn)NR 自發(fā)熒光發(fā)射?？梢?，對(duì)于葡萄藻，DMSO能夠明顯提高其脂質(zhì)含量檢測(cè)的靈敏度，但需要確定最適濃度，濃度過高反而會(huì)對(duì)脂質(zhì)檢測(cè)產(chǎn)生不利影響。本實(shí)驗(yàn)中，DMSO 終濃度以5%為佳，不宜超過15%。

圖2 二甲基亞砜質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響Fig.2 Effect of DMSO concentrations on lipid content determination of B.braunii.

2.3 尼羅紅濃度對(duì)脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響

NR 的濃度是影響其染色效果的關(guān)鍵因素，不同微藻的使用濃度差別很大(0.01～100μg/mL)，已報(bào)道綠藻的NR 終濃度一般為0.3～2.0μg/mL[9-13,17,23]。實(shí)驗(yàn)考察了NR 終濃度為0.2～2.0μg/mL 時(shí)對(duì)葡萄藻脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響，其他條件為：DMSO 終濃度為5%，40℃染色10 min。熒光發(fā)射光譜(圖3)顯示，脂熒光發(fā)射峰的波長(zhǎng)在 NR 濃度較低時(shí)稍有紅移(555～568 nm)，而濃度較高時(shí)基本保持不變，這與胡小文等[22]報(bào)道的相似。隨NR 濃度的提高，脂發(fā)射熒光先增強(qiáng)后減弱，最大熒光值出現(xiàn)在終濃度為1.0μg/mL 時(shí)。當(dāng)終濃度大于1.3μg/mL 時(shí)脂發(fā)射熒光逐漸減弱，NR 發(fā)射熒光逐漸增強(qiáng)。當(dāng)終濃度為2.0μg/mL 時(shí)，NR 的熒光發(fā)射峰甚至?xí)哂诓?yán)重干擾脂熒光發(fā)射峰。因此對(duì)于葡萄藻，NR 終濃度以1.0μg/mL 為佳，不宜超過1.7μg/mL。

圖3 尼羅紅濃度對(duì)脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響Fig.3 Effect of Nile red concentrations on lipid content determination of B.braunii.

2.4 染色時(shí)間和溫度對(duì)脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響

染色時(shí)間和溫度是影響染色效果的兩個(gè)重要因素，已報(bào)道的時(shí)間和溫度通常分別為1～10 min、25℃～40℃，條件太低時(shí)染色效果不佳，太高時(shí)則可能造成熒光淬滅[9-13,23]。如圖4所示，實(shí)驗(yàn)考察了染色時(shí)間為1～30 min 及溫度為20℃～60℃時(shí)對(duì)葡萄藻脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響。脂發(fā)射熒光強(qiáng)度隨染色時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的提高都呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)。隨染色時(shí)間延長(zhǎng)，脂熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)在564～571 nm 范圍內(nèi)發(fā)生藍(lán)移，相對(duì)熒光強(qiáng)度在染色1 min 時(shí)最低，5 min和10 min 時(shí)顯著提高，20 min 及更長(zhǎng)時(shí)間則顯著減弱。隨染色溫度的提高，脂熒光發(fā)射蜂的波長(zhǎng)基本保持不變，相對(duì)熒光強(qiáng)度在溫度為40℃時(shí)達(dá)到最大值，而后顯著減弱，60℃時(shí)熒光值已降低了83.5%。因此，葡萄藻的染色時(shí)間和溫度以10 min、40℃為佳，這與Chen 等[9]以小球藻為材料的研究結(jié)果一致。

圖4 染色時(shí)間(A)和溫度(B)對(duì)脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響Fig.4 Effect of staining time (A) and temperature (B) on lipid content determination of B.braunii.

2.5 藻細(xì)胞密度對(duì)脂質(zhì)含量檢測(cè)的影響

考察被測(cè)藻液的細(xì)胞密度與相對(duì)熒光強(qiáng)度間的相關(guān)性，不僅可檢驗(yàn)測(cè)量方法的可靠性，而且可確定適于檢測(cè)的細(xì)胞密度范圍，有利于脂質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定和不同藻樣脂質(zhì)含量的比較研究[23]。采用上述改進(jìn)方法測(cè)定不同細(xì)胞密度(OD560)藻液的相對(duì)熒光強(qiáng)度，并對(duì)二者進(jìn)行回歸分析。結(jié)果顯示(圖5)，隨著藻細(xì)胞密度，即脂質(zhì)含量的增加，脂發(fā)射熒光強(qiáng)度逐漸增加，藻液OD560在檢測(cè)范圍內(nèi)(OD560為0.1～1.1)與藻液相對(duì)熒光強(qiáng)度呈良好的正相關(guān)關(guān)系，R2高達(dá)0.997。可見，藻液細(xì)胞密度OD560為0.1～1.1時(shí)均可利用該方法直接進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 改進(jìn)方法與傳統(tǒng)方法的比較

圖5 藻細(xì)胞密度與相對(duì)熒光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.5 Relationship of OD560 and relative fluorescence intensity.

表1 改進(jìn)方法與傳統(tǒng)尼羅紅染色方法的比較Table 1 Comparison of modified and traditional Nile red methods

為進(jìn)一步檢驗(yàn)本文超聲波處理及染色條件優(yōu)化對(duì)葡萄藻脂質(zhì)檢測(cè)的效果，對(duì)改進(jìn)方法(MethodⅠ)、改進(jìn)方法中不包括超聲波處理(MethodⅡ)，以及Lee 等[17]的傳統(tǒng)方法(MethodⅢ)進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)重復(fù)，各參數(shù)及結(jié)果見表1?？梢钥闯觯倪M(jìn)方法的靈敏度最高，重復(fù)性也最好，相對(duì)熒光強(qiáng)度較其他兩種方法分別提高了12.4%和196.6%，反映重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別由13.60%和10.91%降至1.84%。比較MethodⅠ和Ⅱ可以看出，利用合適的超聲條件對(duì)藻液進(jìn)行前處理能夠明顯提高檢測(cè)的重復(fù)性。由圖1可知，這主要是因超聲波處理提高了藻細(xì)胞的分散度和均勻性，從而提高了藻細(xì)胞定量的準(zhǔn)確性、光譜檢測(cè)的穩(wěn)定性和靈敏度等。比較MethodⅡ和Ⅲ可以看出，染色條件的優(yōu)化顯著提高了葡萄藻脂質(zhì)含量檢測(cè)的靈敏度(P＜0.05)。優(yōu)化的染色條件與傳統(tǒng)方法相比在體系中加入了5% DMSO，并將染色溫度由25℃提高至40℃，由前面結(jié)果可知，染色體系中加入5% DMSO 可使檢測(cè)靈敏度提高約67.4%(圖2)，而染色溫度由20℃提高至40℃僅使其提高約16.8%(圖4B)，因此主要是DMSO 的加入使靈敏度得以顯著提高。綜上可知，改進(jìn)方法能更準(zhǔn)確、靈敏地反映葡萄藻的脂質(zhì)含量。

3 討論

布朗葡萄藻是一種世界廣布的能源微藻，因能合成大量的脂類物質(zhì)而早已引起國(guó)內(nèi)外的極大關(guān)注。在已有研究中，葡萄藻脂質(zhì)含量的測(cè)定通常涉及有機(jī)試劑提取脂質(zhì)及稱重測(cè)量，進(jìn)而可采用各類色譜法進(jìn)行組分分離和分析。應(yīng)用這一程序雖能獲得脂質(zhì)以及其含量、組成、結(jié)構(gòu)等較多信息，但必須確保脂質(zhì)提取完全，同時(shí)避免其分解和/或氧化，前處理復(fù)雜且樣品用量大，在高通量檢測(cè)方面受到明顯制約[9-10]。尼羅紅染色熒光光譜法因其靈敏、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)成為目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的快速檢測(cè)方法，然而葡萄藻因其特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，導(dǎo)致傳統(tǒng)檢測(cè)方法的靈敏度和重復(fù)性不甚理想而尚未能在其研發(fā)中得以廣泛應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，引進(jìn)超聲波技術(shù)分散葡萄藻集落細(xì)胞以及二甲基亞砜(DMSO)輔助NR 進(jìn)入細(xì)胞，能夠顯著改善上述問題(表1)，尤其對(duì)于細(xì)胞聚集群體較大、細(xì)胞壁較堅(jiān)厚的藻株具有重要意義。

超聲波技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，其通過空化作用產(chǎn)生沖擊波和高溫高壓，甚至產(chǎn)生電離效應(yīng)和放電，導(dǎo)致空泡周圍的細(xì)胞的膠質(zhì)鞘、壁和質(zhì)膜的擊穿而產(chǎn)生較強(qiáng)的生物學(xué)效應(yīng)[24]。目前在葡萄藻的研發(fā)中，超聲波技術(shù)多用于輔助脂質(zhì)的提取[17,25]，而用于制備光譜檢測(cè)樣品還鮮見報(bào)道。由圖1和表1可知，利用超聲波處理葡萄藻液能夠顯著提高細(xì)胞的分散度和均勻性，使取樣時(shí)藻細(xì)胞定量的準(zhǔn)確性、光譜檢測(cè)的穩(wěn)定性和靈敏度得以提高，對(duì)利用光譜法準(zhǔn)確測(cè)定葡萄藻生物量和脂質(zhì)含量起到重要作用。這一結(jié)果對(duì)其他以細(xì)胞群體狀態(tài)存在的單細(xì)胞或多細(xì)胞藻類同樣具有參考意義。

適宜的NR 染色條件是提高微藻脂質(zhì)檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵。本文優(yōu)化的DMSO 和NR 的終濃度分別為5%和1.0μg/mL，染色時(shí)間和溫度分別為10 min、40℃。與已報(bào)道的一些微藻的染色條件(表2)相比，DMSO 和NR 的濃度具有明顯差異。采用表2中濃度條件進(jìn)行葡萄藻脂質(zhì)含量檢測(cè)時(shí)，其靈敏度僅為優(yōu)化濃度時(shí)的一半左右，濃度過高(＞15%)時(shí)還會(huì)產(chǎn)生NR 熒光發(fā)射峰而對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響(圖2～3)。Doan 等[10]認(rèn)為藻種間因細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)脂滴大小等差異，而導(dǎo)致染色條件不盡相同，這也提示在用尼羅紅熒光光譜法檢測(cè)并比較不同藻種的脂質(zhì)含量時(shí)，宜采用各自適合的染色條件。

另外，圖2～3表明，DMSO 和NR 濃度對(duì)葡萄藻脂質(zhì)檢測(cè)具有很大影響，因而它們?cè)跍y(cè)量體系中的量必須盡可能準(zhǔn)確。先前報(bào)道方法通常在藻液中加入高濃度、微小體積的NR 或DMSO[10,12-13,23]，致使加樣時(shí)的隨機(jī)誤差較大，難以準(zhǔn)確定量。改進(jìn)方法通過設(shè)定染色體系中藻液、DMSO 溶液和NR 溶液的體積比為1∶1∶1，擴(kuò)大了二者的加樣體積，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確和穩(wěn)定。

綜上所述，本改進(jìn)方法有助于快速、靈敏的進(jìn)行布朗葡萄藻脂質(zhì)含量的測(cè)定，這對(duì)于葡萄藻優(yōu)良藻株和培養(yǎng)模式等的快速篩選，以及闡明其脂質(zhì)積累規(guī)律和機(jī)理等研究具有重要意義，為布朗葡萄藻及其他藻類的研究提供了必要的技術(shù)支撐。

表2 幾種微藻的尼羅紅染色條件Table 2 Nile red staining conditions of several microalgae

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