高教琪，袁文杰，陳麗杰，韓錫銅，白鳳武

大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連 116024

生物燃料，作為目前化石燃料的主要替代物，是未來能源工業(yè)的重要發(fā)展方向[1]。生物乙醇是目前為止研究最早、技術最為成熟的生物質能源產品。它既可以作為燃料直接使用，也可以與汽油和柴油以一定比例配混使用。生物乙醇因其具有較高的辛烷值，而且無毒，對環(huán)境污染程度較小，一直以來都被公認為最有可能替代化石能源的生物質能源之一[2]。利用淀粉質原料生產乙醇研究較早，技術也相對比較成熟，已經(jīng)在包括中國在內的世界各國實現(xiàn)工業(yè)化生產。然而，中國人口多、耕地少的基本國情，嚴重制約了目前糧食類淀粉質原料燃料乙醇產業(yè)的規(guī)模化發(fā)展，所以，尋找新的非糧作物代替淀粉質原料進行乙醇的工業(yè)化生產將是未來中國燃料乙醇的主要發(fā)展方向[3]。

我國已將菊芋作為重點發(fā)展的非糧能源植物列入生物產業(yè)發(fā)展的“中華人民共和國國民經(jīng)濟和社會發(fā)展第十一個、第十二個五年規(guī)劃綱要”中。菊芋俗稱洋姜或鬼子姜，與其他農作物相比具有適應性強、耐貧瘠、耐寒、耐旱、種植簡易及產量高等特點[4]，不僅可以為生物能源產品生產開辟新的原料來源，而且有助于生態(tài)環(huán)境保護。菊芋塊莖中的主要成分是菊粉，是由果糖殘基以β-2,1鍵連接而成的線形多聚物[5]，可以被多種微生物分解產生低聚果糖或果單糖，繼而發(fā)酵生產乙醇[6-9]。

集成生物加工(Consolidated bioprocessing，CBP)系統(tǒng)集水解酶生產、底物水解和發(fā)酵為一體，在乙醇發(fā)酵的應用方面具有非常突出的優(yōu)點，是目前利用許多非糧作物生產燃料乙醇經(jīng)濟上最具有競爭能力的技術路線[10-11]。馬克斯克魯維酵母可分泌菊粉酶，將菊粉水解為果糖并發(fā)酵生產乙醇，因此是利用CBP 技術發(fā)酵菊芋生產乙醇的理想菌株[12]。

目前，利用CBP 技術發(fā)酵菊粉類原料生產乙醇的研究已進行多年[6,10-11,13]，主要的研究內容是菌株的篩選、發(fā)酵工藝的開發(fā)等方面，但發(fā)酵時間長，乙醇收率低的問題仍然存在[14]。

菊粉酶的活性是影響CBP 技術的關鍵，而通氣量和底物濃度是影響菊粉酶活性的關鍵因素[15-17]。目前國內外尚沒有文獻對CBP 技術中的這兩個因素進行報道。對于克魯維乙醇發(fā)酵過程，也沒有文獻對其代謝過程進行報道。本文研究通氣量和底物濃度交互作用下的菊粉酶活性及乙醇發(fā)酵情況，并通過測定發(fā)酵過程中的主要副產物，增加對克魯維酵母CBP技術發(fā)酵菊芋生產乙醇過程關鍵因素的了解，為乙醇發(fā)酵條件下的菊粉酶調控打下基礎，以提高菊芋發(fā)酵的生產效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus YX01(ATCC8554，本實驗室馴化后保存)。

1.1.2 主要試劑

菊粉(菊芋的熱水抽提物)購于內蒙古億利生物技術有限公司，經(jīng)實驗測定100 g 菊粉水解可得到85 g 還原糖；蛋白胨、酵母浸粉、3,5-二硝基水楊酸、硫酸、NaOH 等均為國產分析純以上級產品。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：4%(W/V)菊粉，2%(W/V)蛋白胨，1%(W/V)酵母粉，pH 自然。121℃滅菌15 min 后使用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：

①50g/L菊粉，2%(W/V)蛋白胨，1%(W/V)酵母粉，pH 自然。121℃滅菌15 min 后使用；135 g/L②或250 g/L 菊粉，2%(W/V)蛋白胨，1%(W/V)酵母粉，pH 自然。115℃滅菌15 min 后使用。

1.2 方法

1.2.1 50g/L菊粉在不同通氣量條件下的發(fā)酵情況

5 L 發(fā)酵罐中裝入2 L 含有50 g/L 菊粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別按10%的接種量接種培養(yǎng)24 h的種子液，在通氣量分別為0、0.5、1.0 vvm 的條件下，30℃、150 r/min 進行批式培養(yǎng)。分別在0、4、8、12、24、36、48、60、72 h 時取樣，測定生物量、總糖、還原糖、乙醇和酶活，考察在50 g/L 菊粉、不同通氣量條件下K.marxinaus YX01的發(fā)酵情況。

1.2.2 135g/L 菊粉在不同通氣量條件下的發(fā)酵情況

5 L 發(fā)酵罐中裝入2 L 含有135 g/L 菊粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件同1.2.1。分別在0、12、24、36、48、60、72、96 h 時取樣，測定生物量、總糖、還原糖、乙醇和酶活，考察在135 g/L 菊粉、不同通氣量條件下K.marxinaus YX01的發(fā)酵情況。

1.2.3 250g/L 菊粉在不同通氣量條件下的發(fā)酵情況

5 L 發(fā)酵罐中裝入2 L 含有250 g/L 菊粉的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件同1.2.1。分別在0、6、12、24、36、48、60、72、96、120 h 時取樣，測定生物量、總糖、還原糖、乙醇和酶活，考察在250 g/L菊粉、不同通氣量條件下K.marxinaus YX01的發(fā)酵情況。

1.2.4 分析方法

酶活的測定：參照文獻[18]。菊粉酶活性單位定義：一定條件下，以菊粉為底物，每分鐘產生1μmol 果糖所需酶量(U)。

生物量的測定：采用OD 值法，將菌液適當稀釋，在620 nm 處測量其吸光值。

還原糖測定：取適當稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液，采用DNS 法測定糖濃度。

乙醇測定：詳見文獻[19]。

發(fā)酵液甘油和乙酸的分析方法：將發(fā)酵液在10000× g 下離心5 min，取上清液，采用高效液相色譜(HPLC)測定。離子交換柱型號為Aminex HPX-87H。流動相為50 mmol/L 的硫酸溶液(HPLC grade)，流速為0.5 mL/min，柱溫為50℃，RI 檢測器的溫度為50℃。

2 結果與分析

2.1 不同菊粉濃度、不同通氣量條件下的乙醇發(fā)酵情況比較

不同菊粉濃度在不同的通氣量下表現(xiàn)出基本相同的規(guī)律。以250 g/L 菊粉濃度為例，由圖1可見，通氣量為1.0 vvm 和0.5 vvm 時，在發(fā)酵前24 h，總糖濃度快速下降，36 h 左右基本已經(jīng)達到終點；而不通氣情況下，100 h 左右才到達終點；還原糖消耗速率方面，通氣量為1.0 vvm和0.5 vvm 時，在前12 h 左右基本保持穩(wěn)定，或稍有上升，之后迅速下降直至終點時維持在較低水平；在不通氣時，前24 h 還原糖濃度會上升，之后維持一定時間穩(wěn)定，最后下降至較低水平。通氣條件的乙醇發(fā)酵過程明顯快于不通氣條件，且0.5 vvm 與1.0 vvm 并未表現(xiàn)出明顯差異，乙醇濃度在發(fā)酵24 h 時已達到最高；而不通氣條件下，乙醇濃度持續(xù)升高，到發(fā)酵120 h 達到最高。

圖1 250g/L初始碳源濃度時不同通氣條件下K.marxinaus YX01發(fā)酵情況Fig.1 Fermentation of K.marxinaus YX01 under different aeration rates at 250 g/L.(A)1.0 vvm.(B)0.5 vvm.(C)0.0 vvm.

出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于接種后 K.marxinaus YX01分泌的菊粉酶迅速將底物降解成為供其自身利用的果糖等還原糖，通氣情況下，糖的利用速率快，沒有出現(xiàn)還原糖的積累；但在乙醇濃度方面，不通氣時達到84.74 g/L，明顯高于1.0 vvm 和0.5 vvm 時，是由于在有氧且碳源不足情況下，乙醇作為碳源被重新利用，并且大通氣量導致部分乙醇揮發(fā)。通氣量為1.0 vvm 和0.5 vvm 時的發(fā)酵情況類似，其原因可能是由于在1.0 vvm 時的生物量略高于0.5 vvm，導致在發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中的溶氧情況相似，而溶氧并非通氣量是培養(yǎng)過程中的關鍵因素。

表1顯示了不同菊粉濃度以及不同通氣量條件下發(fā)酵終點K.marxinaus YX01狀況。不通氣時乙醇發(fā)酵性能明顯較通氣條件有明顯提高，其中最高的乙醇得率為0.442，達到了理論值的86.4%；在135 g/L 時，乙醇發(fā)酵結果也較為理想，不通氣條件乙醇得率為0.438，達到理論值的85.7%；在250 g/L，不通氣條件下，乙醇得率為0.433，為理論值的84.7%。但是，隨著初始底物濃度的增加，乙醇發(fā)酵結果有所下降，而且終點時殘?zhí)菨舛纫裁黠@增加，這種現(xiàn)象可能由于高濃度底物對于微生物的生長有一定影響，而且糖轉化形成了較高濃度的乙醇，對微生物在發(fā)酵后期的生長產生了較為嚴重的抑制作用。

2.2 K.marxinaus YX01在不同發(fā)酵條件下菊粉酶的表達情況

由圖2可以看出，K.marxinaus YX01菊粉酶的表達受到高濃度碳源的抑制，而且通氣條件下酶活高于不通氣條件下的酶活。在50 g/L 時，1.0 vvm 條件下，最高酶活力為21.54 U/mL，而不通氣條件下只有9.34 U/mL；但是，當糖濃度達到250 g/L 時，酶活力受通氣量的影響作用不再顯著，在所有情況下，菊粉酶活力都處于相對較低水平，是由于較高的糖濃度對于菊粉酶產生了嚴重的抑制作用。綜合圖1的結果，可以看到菊粉酶的活力與乙醇的發(fā)酵速度呈正相關，說明CBP 技術中糖的水解速率是工藝的關鍵控制點。

表1 K.marxinaus YX01在不同菊粉濃度、通氣量條件下的發(fā)酵情況Table 1 Comparison of the fermentation by K.marxinaus YX01 under conditions of different inulin concentrations and aeration rates

圖2 發(fā)酵96 h 時菊粉酶在不同發(fā)酵條件下的表達活性Fig.2 Inulinase activity under different conditions at 96 h.

2.3 不同發(fā)酵條件下發(fā)酵液中副產物的分析

在乙醇發(fā)酵過程中，甘油和乙酸等副產物會伴隨乙醇的產生而產生，這對于乙醇的發(fā)酵來說是不利的，它導致了發(fā)酵效率的降低。

圖3 不同初始碳源濃度和不同通氣量條件下甘油和乙酸濃度隨時間的變化Fig.3 Concentration changes of glycerol and acetic acid under conditions of different inulin concentrations and aeration rates.(A)50 g/L.(B)135 g/L.(C)250 g/L.

由圖3可以看出，不同的發(fā)酵條件對于甘油的含量具有較大影響。甘油的產生伴隨著乙醇發(fā)酵過程，且表現(xiàn)出同樣的趨勢。隨著初始碳源濃度的增加，甘油的合成量明顯增加，這主要是由于細胞在高滲條件下，大量合成甘油可以保護細胞不受損傷，在250 g/L 時，甘油含量是50 g/L時的3倍；但是隨著通氣量的增加，甘油的合成受到了抑制，這可能是由于較高的氧化環(huán)境不利于甘油途徑的進行。甘油具有保護細胞、調節(jié)細胞的氧化還原水平等作用[20]，所以在一定程度上來說，甘油的積累有利于細胞生長，但是在乙醇的生產工業(yè)中，甘油的合成分流了流向乙醇的碳源，降低了乙醇得率，同時在精餾過程中，甘油只能作為廢水排放，造成了碳源的浪費[21]。

另一種副產物乙酸主要來自于乙醛或乙醇的氧化。乙酸也是隨著發(fā)酵過程的延長而逐漸積累，但是與甘油相反，乙酸的產量隨著通氣量的增加而增高。這可能由于在高通氣條件下，流向甘油途徑的碳受到抑制，而流向乙醇、乙酸的碳增加。但是由表1結果來看，高通氣量降低了乙醇的得率，可能是由于部分乙醇在有氧條件下被氧化形成乙酸的原因。

3 討論

目前有關通氣量和底物濃度對K.marxinaus乙醇發(fā)酵和菊粉酶表達影響的研究并不多。我們的研究結果表明，相對厭氧和高底物濃度的條件不利于K.marxinaus YX01菊粉酶的分泌但有利于乙醇發(fā)酵，酶和乙醇的產率受通氣量影響顯著，隨通氣量增大，菊粉酶活力上升而乙醇得率隨之降低，這與Bernardo 等[15]的研究結果相似。較高的底物濃度嚴重抑制了菊粉酶活力但對乙醇得率影響不是很明顯，但是菊粉酶活力的降低，延長了發(fā)酵時間，大大降低了乙醇生產效率[22]。

發(fā)酵過程副產物主要為乙酸和甘油，且與釀酒酵母乙醇發(fā)酵過程副產物的變化趨勢有相似之處[20]。實驗證明，乙酸和甘油對菊粉酶活性沒有明顯抑制作用，但無疑副產物的產生降低了乙醇產量。發(fā)酵過程中，與乙醇對于細胞的毒害作用相比，副產物乙酸由于濃度相對較低，其毒害作用影響不大。

解決高效菊粉酶活力和高乙醇產量之間的矛盾是利用K.marxinaus 實現(xiàn)菊粉類物質CBP技術的關鍵。今后的研究工作可從以下兩個方面開展：一是進一步確定滿足菊粉酶高表達與乙醇高得率的通氣條件；二是找到調控菊粉酶表達的相關轉錄因子，利用分子生物學的方法進行改造，實現(xiàn)其在乙醇發(fā)酵條件下的可控表達。

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