呂滋建,李愛香,李秋紅,韓 冰,張 偉

(山東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,山東淄博255091)

殼聚糖接枝聚乙烯亞胺的合成與表征

呂滋建,李愛香,李秋紅,韓 冰,張 偉

(山東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,山東淄博255091)

用一種簡單有效的方法合成了穩(wěn)定的殼聚糖接枝聚乙烯亞胺接枝共聚物(CHI-g-PEI).首先利用高碘酸鹽對殼聚糖進(jìn)行氧化,合成含醛基的殼聚糖；然后利用PEI上的氨基與醛基的席夫堿反應(yīng)進(jìn)行接枝；最后用硼氫化鈉(NaBH4)還原亞胺,得到穩(wěn)定的接枝共聚物CHI-g-PEI.研究了反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對氧化殼聚糖產(chǎn)率的影響,以及PEI用量對接枝率的影響.產(chǎn)物和中間體用紅外光譜(IR)、核磁譜圖(1H-NMR)和紫外可見光譜(UV-Vis)等進(jìn)行了表征.

殼聚糖；聚乙烯亞胺；接枝聚合物；基因載體

基因治療是將人的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用,從而發(fā)揮治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)技術(shù).基因治療的關(guān)鍵之一在于開發(fā)安全、高效的基因遞送體系(基因載體).目前常用的基因載體主要有病毒載體和非病毒載體兩大類.常見的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和皰疹病毒等.病毒載體對大多數(shù)靶細(xì)胞具有高效的轉(zhuǎn)染率,但是價(jià)格比較昂貴,容易引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)并可能致癌,安全性不高.而非病毒載體具有低細(xì)胞毒性和低免疫反應(yīng)、安全性高等特點(diǎn),可以克服病毒載體的致命缺陷,已經(jīng)引起研究者的廣泛關(guān)注.近年研究較多的是陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物兩大類,由于永久正電荷的存在,它們可以通過靜電相互作用與帶有負(fù)電荷的DNA形成復(fù)合物.但是陽離子脂質(zhì)體經(jīng)過靜脈注射后,會(huì)與血清蛋白結(jié)合,被單核巨噬細(xì)胞吞噬,導(dǎo)致靶向性差且轉(zhuǎn)染率較病毒載體低；并且作為基因載體,它的毒性較大,產(chǎn)量也不高.因此,安全、高效的陽離子聚合物在基因治療方面顯示了巨大的潛力.目前應(yīng)用于基因載體的陽離子聚合物常見的有聚乙烯亞胺(PEI)、聚-L-賴氨酸(PLL)、明膠和殼聚糖等.PEI是陽離子聚合物的典型代表,它具有高正電荷密度,并在較寬p H范圍內(nèi)具有很強(qiáng)的緩沖能力,通過靜電作用結(jié)合DNA分子,是目前公認(rèn)轉(zhuǎn)染率較高、應(yīng)用最為廣泛的陽離子類基因載體［1］.但它也對細(xì)胞產(chǎn)生較大的毒性,PEI的體內(nèi)毒性和PEI/DNA復(fù)合物粒子易聚集的特性都限制了它的臨床應(yīng)用.殼聚糖是安全無毒、生物相容性好的多聚陽離子,且免疫原性低、生物黏附性好,并具有獨(dú)特的跨細(xì)胞膜運(yùn)輸能力,是一種有效的基因傳遞載體,從分子量只有幾千的寡聚殼聚糖到分子量幾十萬的高分子量殼聚糖,都已被證明具有基因轉(zhuǎn)染作用［2-4］.但其相對較低的轉(zhuǎn)染效率和生理p H環(huán)境下的難溶性仍是其應(yīng)用中的主要障礙［5］.因而,近年來,研究者們將目光轉(zhuǎn)向了殼聚糖的各種改性衍生物［6-13］.

本文研究用一種相對簡單有效的方法合成穩(wěn)定的殼聚糖接枝聚乙烯亞胺接枝共聚物(CHI-g-PEI),并對反應(yīng)過程和產(chǎn)物進(jìn)行詳細(xì)表征.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

殼聚糖(CHI,分子量20 000Da,脫乙酰度90%)從濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司購買；支化聚乙烯亞胺(PEI,分子量1 800Da)從Sigma-Aldrich公司購買.高碘酸鉀,硼氫化鈉,冰醋酸,醋酸鈉從上海試劑一廠購買.

1.2 CHI-g-PEI的合成

CHI-g-PEI分三步合成.首先用高碘酸鉀氧化殼聚糖.將殼聚糖(2 mmol/L)和高碘酸鉀(78 mmol/L)分別溶解在p H=4.5的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液中,分別用N2鼓泡脫氣,并冷至4℃,將兩溶液混合反應(yīng)12h,加入乙二醇終止(10%V/V)反應(yīng).溶液用截留分子量為3 500的透析袋在0.2mol/L p H=4.5的NaCl溶液中透析3d,然后再在p H= 4.5的緩沖溶液中透析3d,取50m L溶液再用去離子水透析3d,凍干測試,其余溶液用于下一步的接枝反應(yīng).

然后,用PEI和氧化殼聚糖的溶液在p H=4.5的緩沖溶液中4℃反應(yīng)48h,取50m L反應(yīng)液在去離子水中透析3d凍干測試,其余的溶液用于下一步的反應(yīng).

最后,反應(yīng)液用硼氫化鈉還原(2g硼氫化鈉/1g殼聚糖),4℃反應(yīng)48h,在去離子水中透析3d,凍干.

1.3 產(chǎn)物及其中間體的表征

共聚物CHI-g-PEI及其中間體的組成采用核磁(1H-NMR)和紅外光譜(IR)測定.1H-NMR采用采用D2O為溶劑,用Bruker AV300核磁光譜儀上測定；FT-IR分析采用KBr壓片法,20SX分光光度計(jì)測定.氧化殼聚糖的氧化產(chǎn)率在上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的723型紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行測定.

2 結(jié)果與討論

CHI-g-PEI的合成路線如圖1所示.首先用高碘酸鉀氧化殼聚糖,得到含醛基的殼聚糖；然后使PEI與殼聚糖的上的醛基發(fā)生席夫堿反應(yīng),得到接枝共聚物；最后用NaBH4還原亞胺得到穩(wěn)定的CHI-g-PEI.

圖1 CHI-g-PEI的合成路線

2.1 殼聚糖的氧化反應(yīng)

我們選擇用高碘酸鉀對殼聚糖進(jìn)行氧化.氧化產(chǎn)率可以在將反應(yīng)液透析、凍干得到固體之后通過核磁氫譜測定,此方法比較準(zhǔn)確,但不方便；為了更方便快捷的測定氧化產(chǎn)率,我們利用紫外可見分光光度計(jì)法測定.首先選擇波長為245nm做p H=4.5時(shí)高碘酸鉀的工作曲線,如圖2所示.然后,反應(yīng)過程中取樣用紫外可見測試剩余高碘酸鉀的濃度,根據(jù)消耗的高碘酸鉀的量計(jì)算氧化產(chǎn)率.得到反應(yīng)時(shí)間與氧化產(chǎn)率的關(guān)系如圖3所示.

從圖3中可看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,殼聚糖的氧化產(chǎn)率隨之增加.反應(yīng)開始時(shí),由于高碘酸鉀的初始濃度較高,氧化產(chǎn)率增加很快,反應(yīng)1h氧化產(chǎn)率就達(dá)到47.1%；隨著反應(yīng)的進(jìn)行,高碘酸鉀的濃度逐漸降低,反應(yīng)速率減慢,當(dāng)反應(yīng)5h時(shí),氧化產(chǎn)率為53%,反應(yīng)6h時(shí),氧化產(chǎn)率為53.1%,增加很小.因此,我們選擇6h時(shí)結(jié)束反應(yīng).

圖2 高碘酸鉀工作曲線圖

圖3 反應(yīng)時(shí)間與氧化產(chǎn)率關(guān)系圖

考慮到反應(yīng)溫度可能對最終殼聚糖氧化產(chǎn)率有影響,我們采用不同的溫度做了對比實(shí)驗(yàn),得到產(chǎn)物的氧化產(chǎn)率,結(jié)果見表1.由表1可見,不同溫度下殼聚糖的最終氧化產(chǎn)率相差不大,說明反應(yīng)溫度對氧化產(chǎn)率的影響不大.

表1 反應(yīng)溫度對殼聚糖氧化產(chǎn)率的影響

圖4為殼聚糖的核磁譜圖.化學(xué)位移δ=3.0處對應(yīng)于殼聚糖上與氨基相連的碳上的質(zhì)子峰,δ= 3.3～4.1處對應(yīng)于殼聚糖糖環(huán)上的5個(gè)氫的質(zhì)子峰,δ=3.3～4.1和δ=3.0處的質(zhì)子峰的峰面積之比為4.7.與圖5氧化殼聚糖的1H-NMR相比,化學(xué)位移δ=3.0處質(zhì)子峰峰面積大大減小,說明殼聚糖被氧化.比較化學(xué)位移δ=3.0和δ=3.3～4.1處質(zhì)子峰的峰面積,可以計(jì)算出氧化產(chǎn)率YH%,計(jì)算公式如下：

其中,YH%為氧化產(chǎn)率,I1為δ=3.0處的質(zhì)子峰的峰面積,I2為δ=3.3～4.1處的質(zhì)子峰的峰面積.由上式計(jì)算出,殼聚糖的氧化產(chǎn)率為50.5%.與紫外光譜法所得結(jié)果53.1%接近,因而,我們可以用紫外光譜法監(jiān)測反應(yīng)過程.

圖4 殼聚糖（CHI）的1H-NMR譜圖

圖5 氧化殼聚糖的1H-NMR譜圖

2.2 殼聚糖的接枝聚合和還原反應(yīng)

高碘酸鉀氧化得到的氧化殼聚糖上醛基與PEI上的端胺基進(jìn)行席夫堿反應(yīng),得接枝聚合物CHI-g-PEI,然后用硼氫化鈉還原亞胺,得最終產(chǎn)物.圖6為硼氫化鈉還原后CHI-g-PEI的1H-NMR譜圖.化學(xué)位移δ=2.3～2.9處對應(yīng)于PEI上的質(zhì)子峰(4個(gè)H),δ=3.3～4.1對應(yīng)于殼聚糖環(huán)上的質(zhì)子峰.說明成功進(jìn)行了接枝反應(yīng).并且,比較這兩處質(zhì)子峰的峰面積,可計(jì)算出接枝率.具體公式如下：

其中：1 800和20 000分別是PEI和CHI的分子量,43和161分別是PEI和CHI結(jié)構(gòu)單元的分子量,I1/I2是化學(xué)位移δ=2.3～2.9的峰面積與δ= 3.3～4.1的峰面積的比值,n為接枝率.由數(shù)據(jù)求得PEI的接枝率為7.9%.

殼聚糖在水中溶解度很小,接枝反應(yīng)完成后,殼聚糖接枝物在水中可完全溶解,也說明接枝反應(yīng)是成功的.

圖7是CHI和還原后接枝產(chǎn)物CHI-g-PEI的IR譜圖.CHI-g-PEI在1 100cm―1波數(shù)處的吸收峰比殼聚糖的弱,且CHI-g-PEI在1460cm―1波數(shù)處比殼聚糖有一個(gè)更強(qiáng)的吸收峰,這些現(xiàn)象也說明成功合成了CHI-g-PEI接枝共聚物.

圖6 CHI-g-PEI的1H-NMR譜圖

圖7 CHI和CHI-g-PEI的IR譜圖

為了探究PEI的加入量對接枝率的影響,固定殼聚糖的量不變,氧化產(chǎn)率不變,取不同質(zhì)量的PEI做對比實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,PEI的用量不同,所得接枝率也不同.當(dāng)PEI的質(zhì)量為0.9g時(shí),接枝率為7.9%；而將PEI的質(zhì)量提高至1.4g,接枝率增加至19.6%.PEI的用量越大,所得接枝率越高.這是因?yàn)?PEI加入量越多,所含端氨基的數(shù)目也就越多,與氧化殼聚糖上的醛基反應(yīng)的幾率也就越大,因而接枝率越高.因此,我們可以通過控制PEI的加入量來得到各種不同接枝率的接枝共聚物.

3 結(jié)束語

通過高碘酸鉀對殼聚糖進(jìn)行氧化的含醛基的殼聚糖,然后利用PEI上的氨基與醛基的席夫堿反應(yīng)進(jìn)行接枝,最后還原得到殼聚糖接枝聚乙烯亞胺共聚物.研究結(jié)果表明,氧化反應(yīng)在6h結(jié)束,可用紫外可見光譜監(jiān)測反應(yīng)過程.反應(yīng)溫度對殼聚糖的氧化反應(yīng)產(chǎn)率影響不大.紅外光譜和產(chǎn)物的水溶性說明接枝反應(yīng)成功進(jìn)行,且接枝率隨PEI的用量而增加.

［1］張璇,潘仕榮.非病毒基因載體聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物緩沖容量的研究［J］.中南藥學(xué),2009,7(4)：259-262.

［2］Liu W G,Yao K D.Chitosan and its derivatives-a promising non-viral vector for gene transfection［J］.J Controlled Release, 2002,83(1)：1-11.

［3］Chae S Y,Son S,Lee M,et al.Deoxycholic acid-conjugated chitosan oligosaccharide nanoparticles for efficient gene carrier［J］. J Controlled Release,2005,109(1-3)：330-344.

［4］Kim D G,Jeong Y I,Nah J W.All-trans retinoic acid release from polyion-complex micelles of methoxy poly(ethylene glycol) grafted chitosan［J］.J Appl Polym Sci,2007,105(6)：3246-3254.

［5］Hirano S,Yamaguchi Y,Kamiya M.Novel N-saturated-fatty-acyl derivatives of chitosan soluble in water and in aqueous acid and alkaline solutions［J］.Carbohydr Polym,2002,48(2)：203-207.

［6］張未,潘仕榮,張璇,等.聚乙二醇-殼聚糖共聚物作為基因傳遞載體的體外研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,43(8)：848-854.

［7］Jiang X,Dai H,Leong K W,et al.Chitosan-g-PEG/DNA complexes deliver gene to the rat liver via intrabiliary and intraportal infusions［J］.J.Gene.Med.,2006,8(4)：477-487.

［8］Wong K,Sun G B,Zhang X Q,et al.PEI-g-chitosan,a novel gene delivery system with transfection efficiency comparable to polyethylenimine in vitro and after liver administration in vivo［J］.Bioconjugate Chem.,2006,17：152-158.

［9］Jiang H L,Kim You K Y,Rohidas A,et al.Chitosangraftpolyethylenimine as a gene carrier［J］.Journal of Controlled Release,2007,117：273-280.

［10］Lun L Y,Shiang P Y,Hung C B,et al.Poly(ethyleneimine)-g-chitosan using EX-810 as a spacer for nonviral gene delivery vectors［J］.J.Biomed.Mater.Res.A,2009,88(4)：1058-1068.

［11］Li M C,Su S,Xin M H,et al.Relationship between N,N-dialkyl chitosan monolayer and corresponding vesicle［J］.J Colloid and Interface Science,2007,311：285-288.

［12］金旭,朱敦皖,張超,等.十二烷基化殼聚糖基因支架血管內(nèi)基因轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)研究［J］.生物醫(yī)學(xué)工程與臨床,2006,10(6)：342-345.

［13］Wang X,Yao J,Zhou J P,et al.Synthesis and evaluation of chitosan-graft-polyethylenimine as a gene vector［J］.Pharmazie, 2010,65：572-579.

(編輯:姚佳良)

Synthesis and characterization of chitosan graft polyethyleneimine

LYU Zi-jian,LI Ai-xiang,LI Qiu-hong,HAN Bing,ZHANG Wei
(School of Materials Science and Engineering,Shangdong University of Technology,Zibo 255091,China)

Chitosan graft polyetheneimine copolymers(CHI-g-PEI)were synthesized by a facile method.Firstly,CHI containing formyl group was prepared through oxidation reaction of CHI by periodate potassium.Then graft reaction was carried out between amino of PEI and formyl groups of CHI,and stable graft copolymer of CHI-g-PEI was obtained by reduction reaction by sodium borohydride(NaBH4).The effects of reaction time and temperature on the yield of oxidation CHI and the effect of PEI amount on grafting yield were studied.The product and its precursors were characterized by IR,1H-NMR,and UV-Vis.

chitosan；polyethyleneimine；graft copolymer；gene therapy

1672―6197(2013)01―0001―04

O631

A

2013- 01- 01

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金資助項(xiàng)目(2010BSB01009)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2012BQ008)；山東理工大學(xué)青年教師發(fā)展支持計(jì)劃.

呂滋建,男,alv@sdut.edu.cn；通信作者：李愛香,女,axl@sdut.edu.cn