周亞民 葉領云

(東莞理工學院 化學與環(huán)境工程學院，廣東東莞 523808)

氯霉素(CAP)是一類廣譜抗生素，常用于動物各種傳染性疾病的治療，對多種病原菌有較強的抑制作用，曾在水產養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應用，同時也帶來了水產品中氯霉素殘留的嚴重問題〔1－3〕。氯霉素對人的造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)具有嚴重的毒性反應，有可能引發(fā)人的再生障礙性貧血，還會引起視神經炎、皮疹等不良反應。在美國僅允許氯霉素應用于非食用性動物，規(guī)定在任何動物性食品中不得檢出氯霉素。歐共體禁止氯霉素應用于產奶母牛和產蛋雞，在其他動物性食品中的含量也做了限制。目前常用的檢測氯霉素的方法有液相色譜法、放射免疫分析法、酶聯免疫分析法〔4－11〕。高效液相色普法操做復雜，檢測周期長，免疫分析法具有專業(yè)性好，靈敏度高等優(yōu)點〔12－16〕。

壓電傳感器是一種對質量變化非常敏感的石英晶體微天平，厚度剪切壓電石英晶體頻移(ΔF)與晶體表面均勻吸附的極薄層物質質量(ΔM)存在正比例關系?；诿复呋孜锓磻沙恋硎咕C振頻率降低，石英晶體微天平可以用于酶的分析。壓電免疫傳感器技術一般是把抗體固定在壓電石英晶體表面上，依據免疫反應引起的質量及界面粘彈性變化來進行分析。本文基于石英晶體微天平作轉換器的ELISA 用于測量氯霉素的濃度。HRP－CAP 作標記物，抗CAP 抗體通過氨基硅烷化試劑和2－氨基乙硫醇層固定在石英晶片表面上，采用競爭酶聯吸附免疫分析形式，以TMB 作酶的底物。結合在晶片上的酶標物催化底物氧化形成二聚體沉淀使石英晶體諧振頻率降低，據此測量酶標物HRP－CAP 和待測物的CAP 量。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CN3165 型高分辨計數器(石家莊無線電四廠)，石英晶體諧振器(北京七0 七廠):AT 切型，9 MHz 雙面鍍金電極，晶片直徑12 mm，電極直徑6 mm，諧振電路為自制TTL－IC 電路，CS501 型超級恒溫器(重慶實驗設備廠)，氯霉素、酶標氯霉素、氯霉素抗體購自深圳市博奧通科有限公司，γ－氨丙基三乙基硅烷，2－氨基乙硫醇，3，3，5，5－四甲基聯苯胺，HRP 購自Sigma 公司。培育溶液為含1%BSA 的和1 mM EDTA 的0.1 M 的磷酸鹽緩沖液，洗液為PH = 7.4 的0.1 M 的PBS 溶液 酶底物溶液為含0.5 mM TMB 和1 mM H2O2的pH 5.0 的磷酸鹽緩沖液。不同濃度的CAP 和HRP－CAP 溶液用含有1%(w/w)的牛血清蛋白的0.1 M tris－HCl 緩沖溶液稀釋標準CAP 和HRP－CAP 溶液而得。

1.2 CAP 抗體的固定方法

石英晶片依次用丙醇浸泡10 分鐘，1∶1 的乙醇濃鹽酸中浸泡30 分鐘，濃硫酸中浸泡30 分鐘，5 M氫氧化鈉浸泡10 分鐘，用蒸餾水漂洗后，干燥，浸入2%的3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑的無水乙醇溶液中，20 分鐘后用無水乙醇沖洗干凈。在105℃環(huán)境下加熱1 小時，得到富含NH2基的表面，然后在2－氨基乙硫醇溶液中自組裝6 小時，用蒸餾水清洗晶片，然后用3%的戊二醛PBS 溶液活化三小時，洗去游離的戊二醛，將100 μL 體積的的CAP 抗體溶液涂覆在戊二醛活化過的晶片上，在冰箱中過夜，洗去游離的抗體后，用0.5 mg·mL－1的新配置的NaBH4溶液還原戊二醛與氨基形成的席夫堿以穩(wěn)定蛋白質修飾層。最后晶片用PBS 清洗放入4℃冰箱中保存。

1.3 免疫分析過程

免疫分析采用競爭ELISA 方法，如圖1 所示，晶片用100 μL 包含HRP－CAP 和CAP 的培育溶液培育，使待測的CAP 與HRP－CAP 競爭結合到固定在晶片上的抗CAP 抗體上。用洗液洗去游離的CAP 及HRP－CAP 后，將晶片放入pH = 5.0 的磷酸緩沖溶液中，并注入TMB 溶液，頻率穩(wěn)定后，記下頻率值F1，加入H2O2，記錄頻率F2，在5 分鐘內的頻移變化值ΔF = F1－F2用來確定結合在晶片上HRPCAP 的量，從而間接測定溶液中CAP 的濃度。

圖1 測定氯霉素競爭免疫分析法分析程序

1.4 傳感器敏感面的再生方法

測試完成后，用50% 的二甲基亞砜水溶液溶解沉淀，然后用pH=2.3 的甘氨酸－鹽酸緩沖溶液洗滌，解離晶體表面上免疫復合物，并洗去CAP 和HRP－CAP，從而使免疫傳感器敏感面得到再生。

2 結果與討論

2.1 抗體固定效果評價

對CAP 抗體固定效果進行評價，同樣的條件，通過3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑將抗體固定在石英晶體微天平表面制成免疫傳感器，通過3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑和2－氨基乙硫醇將抗體固定在石英晶體微天平表面制成免疫傳感器。固定有抗CAP 抗體的石英晶片用0.5 μg·L－1的HRP－CAP 培育50 分鐘，用PBS 溶液沖洗三次，洗去非特異性吸附的酶標物，浸入0.5 mM TMB 的PBS 溶液中，待晶片諧振頻率穩(wěn)定后，加入H2O2，并記錄石英晶片的諧振頻率。作為對比，未用酶標物培育的石英晶片在同樣濃度的TMB 和H2O2溶液中，并監(jiān)測石英晶體的諧振頻率。如圖2 所示，傳感器經酶標物CAP 培育后，在TMB+ H2O2底物溶液中，晶片諧振頻率不斷降低，這是因為經過免疫反應，CAPHRP 結合在晶片上，它能催化TMB(1)與H2O2反應在晶片形成沉淀(2)。而未經CAP－HRP 培育的晶片在TMB + H2O2溶液中，晶片諧振頻率基本保持不變。這說明在酶催化質量放大的石英晶體微天平傳感器中，TMB 作為HRP 的底物能有效地檢測HRP。通過3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑將抗體固定在石英晶體微天平表面制成免疫傳感器的頻率響應值為57 Hz，同樣條件下通過3－氨基丙基三乙氧基硅烷化試劑和2－氨基乙硫醇將抗體固定在石英晶體微天平表面制成免疫傳感器頻率響應值為82 Hz，說明通過有機硅烷試劑和2－氨基乙硫醇自組裝可以在石英晶體微天平的金電極表面固定更多的CAP 抗體，免疫傳感器有更大的響應。

圖2 傳感器頻率響應與時間關系

2.2 培育溶液pH 值的影響

免疫分析過程中，溶液pH 值影響蛋白質荷電性，從而影響抗體對抗原結合力。在pH 為5.5 ～8.5的范圍里考察了培育溶液pH 值對傳感器響應的影響，如圖3 所示，傳感器在0.7 μg·mL－1HRP－CAP培養(yǎng)液里培育50 分鐘，pH=7.0 ～7.5 的培育溶液最有利于免疫反應。在pH 高于7.5 或pH 低于6.5的溶液中培育，傳感器的響應均較低。實驗中選用pH =7.5 的磷酸鹽緩沖溶液作為培育溶液用來分析CAP 的濃度。

2.3 HRP－CAP 用量的影響

傳感器的響應大小與其表面上酶標物的量相關，培育液中酶標物的濃度影響結合到傳感器表面上的酶標物的量。為了用較少量的酶標物去獲得較大的響應，考察了培育溶液中酶標物濃度對傳感器響應的影響。如圖4 所示，傳感器在不同濃度的HRP－CAP 培養(yǎng)液里培育50 分鐘，培育溶液中酶標用量增加，傳感器響應增大?；趥鞲衅饔休^大的響應，并用較少的酶標物用量，一個包含0.4 μg·mL－1酶標物的培育液用來測定CAP。

圖3 培育溶液pH 對傳感器電流響應的影響

圖4 培育溶液中HRP－CAP 濃度對傳感器電流響應的影響

2.4 培育時間的影響

在傳感器表面上，抗原抗體發(fā)生免疫反應形成免疫復合物需要一定時間。實驗考察了培育時間對傳感器響應的影響，傳感器在含0.4 μg·mL－1HRP－CAP 和0.4 μg·mL－1CAP 的培育液中培育不同時間并測量頻率響應，如圖5 所示，傳感器在0.7 μg·mL－1HRP－CAP 培養(yǎng)液里培育不同時間，傳感器的響應隨培育時間增加而增大，30 分鐘達到平衡，因此在實驗中取40 分鐘作為培育時間。

圖5 培育時間對傳感器電流響應的影響

圖6 傳感器頻率響應與氯霉素濃度對數值的關系

2.5 傳感器的響應曲線及初步應用

在優(yōu)化的實驗條件測定了傳感器的工作曲線，如圖6 所示，培育液中CAP 濃度高，復合到傳感器表面的HRP－CAP 量的就少，結果傳感器頻率變化值也少。在0.3 ～180 μg·L－1CAP 范圍內，傳感器的響應與CAP 濃度的對數有近似的線形關系。

2.6 測定的選擇性

研究了環(huán)境樣品中存在60 μg·L－1的CAP 時，常見干擾物質氯霉素堿、四環(huán)素、甲基氯霉素、慶大霉素、青霉素、紅霉素、強力霉素、氟甲砜霉素、已酰氯霉素、甲砜氯霉素對測定CAP 的影響，實驗結果如表1 所示。，當干擾物質環(huán)境毒素與環(huán)境樣品CAP 的濃度比為10 時，大多數可能共存的環(huán)境抗生素產生的相對誤差在5%以下;只有氯霉素堿和氟甲砜霉素帶來的的相對誤差大于5%。當干擾物質與環(huán)境水中CAP 的濃度比為100 時，大多數共存環(huán)境抗生素產生的相對誤差在11%以下;只有氯霉素堿帶來的相對誤差超過11%，表明該方法對AFB1 具有很好的選擇性。

表1 干擾物質對CAP 分析的影響

3 結語

本文描述了以石英晶體微天平作傳感裝置的ELISA 法用于分析水體中CAP 的含量。采用競爭酶聯吸附免疫分析形式，以HRP－CAP 作標記物，TMB 和H2O2作酶的底物，通過辣根過氧化酶催化氧化TMB 生成沉淀，使石英片諧振頻率降低，來測定酶標物和待測物的濃度。免疫傳感器對CAP 的檢測范圍為0.3 ～180 μg·L－1，可以滿足水產養(yǎng)殖行業(yè)中水質檢測的相關要求，它具有裝置簡單，測量方便，靈敏度高等特點。

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