韓世龍，朱曉黎，張猛，郭永團(tuán)，徐云華

臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，常溫常態(tài)下半衰期約150 min，具有免疫激發(fā)、消炎、止痛及溶解髓核內(nèi)蛋白多糖的作用［1］。近年來，臨床上應(yīng)用臭氧經(jīng)皮注射治療腰椎間盤突出癥，自體血臭氧回輸治療缺血性腦卒中，局部吹注臭氧治療難愈性潰瘍均取得了一定進(jìn)展［2-3］。1980年Sweet等［4］曾報(bào)道體外實(shí)驗(yàn)表明，臭氧濃度在0.3×10-6～0.5×10-6時(shí)可抑制40%～60%的腫瘤細(xì)胞，0.8×10-6時(shí)可抑制90%的腫瘤細(xì)胞，但臭氧抑制及殺滅腫瘤的作用尚未為人們所重視，本實(shí)驗(yàn)旨在探索臭氧在腫瘤治療中的新途徑及其安全性和有效性，為臨床臭氧治療實(shí)體腫瘤的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持及臨床指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建模及分組

取普通級(jí)純種成年雄性新西蘭大白兔24只，兔齡4個(gè)月左右，體重2.2～2.5 kg。

1.1.1 動(dòng)物建模選擇VX2荷瘤兔，無菌條件下切取瘤體，取靠近腫瘤邊緣的灰白色魚肉樣實(shí)性瘤組織，無菌生理鹽水中用眼科剪剪成大小約1.0 mm3的瘤塊，滴入慶大霉素注射液1 ml抑菌備用，在實(shí)驗(yàn)兔的兩側(cè)臀部近大腿根處肌肉豐厚處接種VX2瘤株，2周后B超證實(shí)腫瘤直徑達(dá)1.6～3.4 cm，平均（2.3±0.85）cm時(shí)，即為瘤兔模型。

1.1.2 動(dòng)物分組24只VX2瘤兔建模成功后，分為三組，A、B組各9只，C組6只。A組注射醫(yī)用臭氧的濃度為40μg/ml，B組為70μg/ml，C組為假手術(shù)組，即以同樣方法穿刺到位后，不注入任何氣體或液體。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全麻后，B超實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)下刺入5 ml注射器針頭，確定針尖避開周圍血管置入腫瘤中心部分，分別制備40μg/ml和70μg/ml臭氧，抽吸2 ml，監(jiān)測(cè)下回抽證實(shí)未在血管腔內(nèi)，注入腫瘤組織，注射過程中，同樣注意觀察臭氧有無進(jìn)入血管，B超可見腫瘤局部高亮回聲（圖1），于荷瘤兔腫瘤生長(zhǎng)良好的一側(cè)，單點(diǎn)注射，一次性完成。B超再次觀察腫瘤組織大小及毀損區(qū)大小。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

術(shù)后每天觀察瘤兔的一般生活情況，于術(shù)前1 d、術(shù)后1、3 d分別從兔耳緣抽取靜脈血，檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）及肌酐（Cr）水平。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后3 d處死，取瘤體標(biāo)本進(jìn)行HE染色。切取病灶內(nèi)消融灶中心組織及邊緣組織為檢測(cè)標(biāo)本，切除的標(biāo)本立即在4%甲醛液中固定，行HE染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)前經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療后動(dòng)物一般情況

三組動(dòng)物術(shù)后24 h內(nèi)均出現(xiàn)活動(dòng)減少、納差，對(duì)刺激反應(yīng)差，精神萎靡，24 h后基本恢復(fù)正常，以A、B組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)明顯。A、B組各有1只兔于術(shù)中或術(shù)后1 h內(nèi)死亡，2只兔均為術(shù)中注射臭氧后出現(xiàn)呼吸急促、抽泣樣呼吸、躁動(dòng)，唇紺，于胸外按壓胸廓行心肺復(fù)蘇后搶救無效死亡，考慮為實(shí)驗(yàn)初期操作經(jīng)驗(yàn)缺乏，臭氧進(jìn)入血管，氣體栓塞所致，死亡兔均及時(shí)補(bǔ)充。B組1只兔術(shù)后出現(xiàn)短暫性跛行后自愈。余兔均未出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。

2.2 干預(yù)前后血清肝、腎功能變化

干預(yù)前1 d各組血清ALT、AST和Cr水平無明顯差異。術(shù)后1 d各組血清ALT、AST及Cr水平達(dá)到峰值，與術(shù)前1 d相比無顯著差異；術(shù)后3 d血清ALT、AST、Cr水平開始下降并趨于術(shù)前水平，各組間兩兩比較亦無顯著差異（表1～3，圖2）。

表1 各組干預(yù)前后丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平比較（±s）

表1 各組干預(yù)前后丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平比較（±s）

a與術(shù)前比較P＜0.05

?

表2 各組干預(yù)前后天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平比較（±s）

表2 各組干預(yù)前后天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平比較（±s）

a與術(shù)前比較P＜0.05

?

表3 各組干預(yù)前后血清肌酐水平比較（±s）

表3 各組干預(yù)前后血清肌酐水平比較（±s）

a與術(shù)前比較P＜0.05

?

2.3 大體標(biāo)本觀察

肉眼可見臭氧治療兩組腫瘤病灶外有完整包膜存在，沿包膜肌纖維走行逐步解剖腫瘤組織，可見腫瘤局部充血腫脹，腫瘤內(nèi)消融區(qū)周邊為乳白色乳糜樣壞死組織，中間區(qū)液化壞死組織，A、B組間壞死區(qū)大體標(biāo)本無明顯差異。C組接種腫瘤處可見腫瘤呈近似圓柱形，灰白色魚肉樣實(shí)性腫瘤組織。

2.4 病理學(xué)觀察

光鏡下觀察A、B組，消融導(dǎo)致的細(xì)胞壞死形態(tài)基本相同，腫瘤細(xì)胞與周圍正常組織細(xì)胞界限清晰，可見腫瘤細(xì)胞侵犯肌層，腫瘤細(xì)胞可見大片凝固壞死，表現(xiàn)為組織、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，部分形態(tài)尚存，見細(xì)胞破裂、溶解、壞死細(xì)胞碎片。C組鏡下僅見少量壞死腫瘤細(xì)胞，腫瘤與附近組織界限清晰，部分腫瘤細(xì)胞突破肌層向深處生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞排列紊亂，呈巢狀或彌漫性分布，可見大量癌巢形成，細(xì)胞核深染，可見核分裂，異性核（圖3）。

3 討論

3.1 醫(yī)用臭氧治療惡性腫瘤的可行性

臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑，近年來國(guó)內(nèi)醫(yī)生在臨床上主要用于治療腰椎間盤突出癥、缺血性腦卒中及難愈性潰瘍，而對(duì)其在抑制腫瘤生長(zhǎng)和治療腫瘤方面的作用少有報(bào)道。1995年美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院將氧化劑（臭氧、過氧化氫）作為五類抗腫瘤治療方法之一，其中包括螯合作用、代謝治療、細(xì)胞治療和抗氧化劑治療。有報(bào)道臭氧在晚期頭頸部腫瘤患者作為輔助治療與靜脈化療聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果表明臭氧治療可能有助于增加靜脈化療的效果。此外，在另一組晚期頭頸部腫瘤采用化療及放射治療聯(lián)合自血回輸臭氧療法，結(jié)果表明臭氧治療可能既增加靜脈化療效果，又增加放射治療效果［5-6］。2008年有報(bào)道采用經(jīng)皮腹膜內(nèi)注射臭氧治療新西蘭大白兔耳VX2移植瘤，14只荷瘤兔中6只腫瘤消失，取得了滿意的治療效果。國(guó)內(nèi)有報(bào)道經(jīng)皮瘤內(nèi)注射醫(yī)用臭氧治療VX2移植瘤的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，顯示該治療方法可有效控制腫瘤生長(zhǎng)，減少腫瘤轉(zhuǎn)移。

本組實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)皮穿刺瘤體B超引導(dǎo)下直接注射臭氧。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中使用CT為引導(dǎo)方法，發(fā)現(xiàn)缺乏實(shí)時(shí)性，不能降低治療過程中造成氣體栓塞的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)驗(yàn)中改用B超為引導(dǎo)工具，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定位、測(cè)量腫瘤組織大小等操作。預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中先后注射了3～5 ml臭氧觀察，其死亡率均較高，反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2 ml是安全劑量。實(shí)驗(yàn)過程中死亡的2只荷瘤兔出現(xiàn)氣體栓塞等表現(xiàn)，經(jīng)胸外按壓等搶救后未成功，考慮為實(shí)驗(yàn)早期操作者應(yīng)用B超熟練度欠佳及穿刺方法失范有關(guān)。

3.2 醫(yī)用臭氧治療的毒性作用及對(duì)肝腎功能影響

相關(guān)研究證實(shí)臭氧毒性主要表現(xiàn)在以下方面：①有證據(jù)表明臭氧對(duì)氣管、肺臟非常有害，且隨著空氣中臭氧濃度增加，其毒性作用相應(yīng)增加［3，7］。②臭氧作為強(qiáng)氧化劑與DNA、RNA等生物大分子反應(yīng)，可能導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)受損，存在潛在的遺傳毒性。但這一結(jié)論尚存在爭(zhēng)議［8］。③臭氧鞘內(nèi)注射可導(dǎo)致腦脊液中具有細(xì)胞毒性作用的丙二醛水平升高，這表明臭氧有較為確切的神經(jīng)毒性［9-10］。目前尚無其他研究證實(shí)臭氧對(duì)肝腎功能是否有影響。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了兩組不同濃度臭氧局部注入腫瘤前后肝腎功能的變化，結(jié)果表明低劑量瘤內(nèi)注射臭氧后，血清ALT、AST及Cr術(shù)后1 d有輕度升高，3 d后恢復(fù)基線水平，血清ALT、AST及Cr升高后對(duì)肝腎功能的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果證實(shí)，局部實(shí)體內(nèi)注入醫(yī)用臭氧后，不會(huì)對(duì)全身肝腎功能造成損傷，同時(shí)實(shí)驗(yàn)過程中也未發(fā)現(xiàn)其他器官功能的顯著衰退。

3.3 各組術(shù)后大體標(biāo)本和病理分析

本實(shí)驗(yàn)中A、B兩組腫瘤內(nèi)消融區(qū)周邊為乳白色乳糜樣壞死組織，中間有液化壞死組織，病理標(biāo)本可見細(xì)胞溶解、破裂等細(xì)胞壞死表現(xiàn)，兩組無明顯差異，證實(shí)臭氧濃度在40～70μg/ml，其組織破壞、穿透力、消融能力無明顯差異。其可能的機(jī)制為：臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，極不穩(wěn)定，進(jìn)入組織后能與水分子結(jié)合生成過氧化氫、過氧化自由基和羥自由基，其反應(yīng)活性極高，能攻擊細(xì)胞膜、線粒體膜同時(shí)攻擊DNA造成多種形式的損傷，使生物膜破裂導(dǎo)致細(xì)胞核破裂、溶解，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死［11］。同時(shí)自由基與生物膜內(nèi)的不飽和脂肪酸反應(yīng)，造成脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，引起自由基連鎖反應(yīng)，造成附加損傷［12］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醫(yī)用臭氧經(jīng)皮治療實(shí)體腫瘤在嚴(yán)格規(guī)范的操作下是安全的，且對(duì)肝腎功能影響較小，可造成腫瘤組織壞死。本實(shí)驗(yàn)為臭氧在經(jīng)皮治療腫瘤方面的初步實(shí)驗(yàn)，未能觀察干預(yù)治療后瘤兔的生存期，由于條件限制未能觀察單次治療后腫瘤組織的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況及毀損范圍，其對(duì)腫瘤的消融作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。臭氧治療具有價(jià)廉、創(chuàng)傷小、可反復(fù)治療等優(yōu)點(diǎn)，有著廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步探索。

［1］Bocci V.Scientific and medical aspects of ozone therapy：State of the art.Arch Med Res，2006，37：425-435.

［2］Huth KC，Paschos E，Brand K，et al.Effect of ozone on noncavitated fi ssure carious lesions in permanent molars：A controlled prospective clinical study［J］.Am J Dent，2005，18：223-228.

［3］Valacchi G，Pagnin E，Corbacho AM，et al.In vivo ozone exposure induces antioxidant/stress-related responses in murine lung and skin［J］.Free Radic Biol Med，2004，36：673-681.

［4］Sweet F，Kao MS，Lee SC，et al.Ozone selectively inhibits growth of human Cancer cells［J］.Science，1980，209：931-933.

［5］Zanker KS，Kroczek R.In vitro synergistic activity of 5-fluorouracil with low-dose ozone against a chemoresistant tumorcell line and fresh human tumor cells［J］.Chemotherapy，1990，36：147-154.

［6］Clavo B，Ruiz AM.Adjuvant ozonetherapy in advanced head and neck tumors：A comparative study［J］.Evid Based Complement Altemat Med，2004，1：321-325.

［7］Hollingsworth JW，Kleeberger SR，F(xiàn)oster WM.Ozone and pulmonary innate immunity［J］.Pro Am Thora Soc，2007，4：240-246.

［8］Pryor WA，Squadrito GL，F(xiàn)riedman M.A new mechanism for the toxicity of ozone［J］.Toxicol Lett，1995，82-83：287-293.

［9］陳輝，許華，熊源長(zhǎng).醫(yī)用臭氧研究進(jìn)展［J］.國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2009：258-261.

［10］Connor AJ，Laskin JD，Laskin DL.Ozone-induced lung injury and sterile in fi ammation：Role of toll-like receptor 4［J］.Exp Mol Pathol，2012，92：229-235.

［11］Guven A，Gundogdu G，Uysal B，et al.Hyperbaric Oxygen therapy reduces the severity of necrotizing enterocolitis in a neonatal rat model［J］.J Pediatr Surg，2009，44：534-540.

［12］Ballinger CA，Cueto R，Squadrito G，et al.Antioxidantmediated augmentation of ozone-induced membrane oxidation［J］.Free Radic Biol Med，2005，38：515-526.