熊丹萍，劉超群，王宏勛*

（武漢工業(yè)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

假單胞菌一直被認(rèn)為是在有氧條件下引起冷卻肉腐敗的主導(dǎo)作用菌[1-2]。在溫度是唯一或主要的限制因素條件下，假單胞菌在冷藏食品中的生長(zhǎng)速率比其他污染細(xì)菌的生長(zhǎng)速率快30%[3]。近年來(lái)食品微生物預(yù)報(bào)技術(shù)在國(guó)外被廣泛研究。利用數(shù)學(xué)模型的建立，用來(lái)預(yù)測(cè)食品的貨架壽命和微生物學(xué)安全[4]。在我國(guó)冷卻豬肉主要以托盤包裝分割肉的形式在超市進(jìn)行銷售[5]，同時(shí)隨著預(yù)測(cè)微生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)冷鮮肉和魚產(chǎn)品中的腐敗菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)的研究較多[6-9]，但沒(méi)有考慮到冷鮮肉組織的不同對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的影響，所以造成在實(shí)際運(yùn)用中結(jié)果的偏差[10-11]。

本文以冷鮮排骨為研究對(duì)象，建立其在不同溫度下的假單胞菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型并進(jìn)行驗(yàn)證，試圖快速對(duì)冷鮮排骨中假單胞菌的的生長(zhǎng)情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，為建立冷鮮肉品的貨架期預(yù)測(cè)模型提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

冷鮮排骨：中百倉(cāng)儲(chǔ)超市中糧集團(tuán)“家佳康”系列。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

CFC瓊脂：青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（優(yōu)級(jí)純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

CP214（C）型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海恒科技有限公司；手提式蒸汽不銹鋼消毒器（滅菌鍋）：上海三申醫(yī)療器械有限公司；LRH-100C型低溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SK-1快速混合器：金壇市科析儀器有限公司；HBM-400系列樣品均質(zhì)器：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司LR；H-150-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；低溫培養(yǎng)箱：三洋電機(jī)國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.4 恒定溫度下的生長(zhǎng)曲線

選取0℃、5℃、10℃、15℃和20℃為試驗(yàn)溫度，將當(dāng)天購(gòu)買的“冷鮮排骨”5盒分別儲(chǔ)藏在以上5個(gè)溫度條件下，每次從排骨上剪取25g肉，放入無(wú)菌均質(zhì)袋中，并加入225mL無(wú)菌生理鹽，以7次/s的速度拍擊2min，從無(wú)菌均質(zhì)袋中吸取1mL懸液進(jìn)行稀釋，取3個(gè)合適的稀釋梯度，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)重復(fù)，用選擇性培養(yǎng)基CFC瓊脂傾注平皿，并記為第0d，30℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[12-13]。之后每隔0.5d或1d從同一盒排骨中無(wú)菌操作剪取25g如上方法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 一級(jí)模型的擬合及其驗(yàn)證

1.5.1 一級(jí)模型的擬合

應(yīng)用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用Gompertz模型建立0℃～20℃下假單胞菌的一級(jí)模型[14]。Gompertz方程如下：

式中：t為時(shí)間，h；Nt為 t時(shí)的菌數(shù)；N0是初始菌數(shù)對(duì)數(shù)值，lg（cfu/g）；C是最大菌數(shù)Nmax與初始菌數(shù)N0的差值對(duì)數(shù)值，lg（cfu/g）；B是在時(shí)間為M時(shí)的相對(duì)最大比生長(zhǎng)速率，d-1；M是達(dá)到相對(duì)最大生長(zhǎng)速率所需要的時(shí)間，d。

由此，可以通過(guò)以下公式求出U（d-1）、LPD（d）值。U為微生物生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率（d-1），LPD為微生物生長(zhǎng)的延滯期（d）。

其中，最大比生長(zhǎng)速率U=B.C/e，e=2.7182，d-1；遲滯期LPD=M-（1/B），d。

1.5.2 一級(jí)模型的驗(yàn)證

通過(guò)計(jì)算準(zhǔn)確因子（Af）和偏差因子（Bf）來(lái)驗(yàn)證一級(jí)模型的預(yù)測(cè)效果。準(zhǔn)確因子的值越大表明預(yù)測(cè)效果越差，當(dāng)準(zhǔn)確因子值為1時(shí)預(yù)測(cè)效果最為理想。計(jì)算準(zhǔn)確因子Af和偏差因子Bf的公式如（2）和（3）所示。

1.6 二級(jí)模型擬合

二級(jí)模型的擬合同樣運(yùn)用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件，應(yīng)用平方根模型擬合溫度-生長(zhǎng)速率平方根曲線，描述溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響[15]。其關(guān)系式如下：

式中：T是培養(yǎng)溫度，TminU、TminL是最低生長(zhǎng)溫度，指的是微生物沒(méi)有代謝活動(dòng)時(shí)的溫度是通過(guò)外推回歸線與溫度軸相交而得到的溫度；b是系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下假單胞菌生長(zhǎng)曲線

圖1為不同溫度下假單胞菌的生長(zhǎng)曲線。從圖1中可以看出，儲(chǔ)藏的恒定溫度越低，假單胞菌的生長(zhǎng)越緩慢，較高溫度條件下假單胞菌的增長(zhǎng)明顯快于較低溫度條件。在0℃的生長(zhǎng)條件下，假單胞菌在前4d的增長(zhǎng)非常緩慢，從第5d開始增長(zhǎng)加快，在第7d時(shí)菌數(shù)對(duì)數(shù)值為6；在5℃的生長(zhǎng)條件下，前2d假單胞菌的對(duì)數(shù)值僅為4左右，增長(zhǎng)幅度緩慢，從第3d開始數(shù)量增加明顯，對(duì)數(shù)值最高可達(dá)到10；在10℃的生長(zhǎng)條件下，前2d假單胞菌的增長(zhǎng)較緩慢，第3d出現(xiàn)顯著增長(zhǎng)，3d后生長(zhǎng)變緩，趨于平穩(wěn)；在15℃和20℃的生長(zhǎng)條件下，假單胞菌的增長(zhǎng)較快，幾乎沒(méi)有出現(xiàn)增長(zhǎng)緩慢的情況，在僅3.5d的生長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，最大的對(duì)數(shù)值就達(dá)到10。分析表明，溫度越高，假單胞菌增長(zhǎng)越快，且越容易達(dá)到穩(wěn)定期。

圖1 不同溫度下假單胞菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of Pseudomonas under different temperature

2.2 假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的擬合及其驗(yàn)證

2.2.1 一級(jí)模型的擬合

運(yùn)用SAS9.1軟件擬合不同溫度下假單胞菌的生長(zhǎng)曲線。由表1可以看出，判定系數(shù)R2的值較高，并且隨溫度升高R2值逐漸增加，表明Gompertz模型能很好的描述不同溫度下假單胞菌的生長(zhǎng)。

表1 0℃～20℃條件下假單胞菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型Table 1 Growth kinetics model of Pseudomonas at 0℃～20℃

由圖2可知，在5種溫度條件下，假單胞菌預(yù)測(cè)生長(zhǎng)曲線與實(shí)際生長(zhǎng)曲線幾乎重疊，表明模型擬合效果非常好。

利用Compertz模型求得的假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表2）。結(jié)果顯示：0℃條件下最大比生長(zhǎng)速率較低，延滯期較長(zhǎng)，假單胞菌的生長(zhǎng)處于抑制狀態(tài)，隨著溫度的升高，比生長(zhǎng)速率急劇增加，延滯期縮短，當(dāng)溫度升高到20℃時(shí)，延滯期縮短至0.1140d。

2.2.2 一級(jí)模型的驗(yàn)證

用準(zhǔn)確因子（Af）和偏差因子（Bf）來(lái)驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)效果。通過(guò)公式（2）和（3）計(jì)算得到偏差因子和準(zhǔn)確因子的值見表3。從表3可以看出模型的準(zhǔn)確因子和偏差因子均為1左右，表明模型能很好預(yù)測(cè)不同溫度下假單胞菌的生長(zhǎng)。

圖2 不同溫度下假單胞菌生長(zhǎng)的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值Fig.2 Predicted and measured values of Pseudomonas grown under different temperature

表2 0℃～20℃條件下假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of Pseudomonas at 0℃～20℃

表3 預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證Table 3 Evaluation of predict model using the bias factors and accuracy factors

2.3 二級(jí)模型的擬合

用平方根模型擬合溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響。圖3是溫度與比生長(zhǎng)速率的關(guān)系。圖4是溫度與延滯期的關(guān)系。溫度與比生長(zhǎng)速率的模型為方程（6），溫度與延滯期的模型為方程（7）。

圖3 溫度與最大比生長(zhǎng)速率的關(guān)系Fig.3 Relationship between temperature and maximum specific growth rate

圖4 溫度與延滯期的關(guān)系Fig.4 Relationship between temperature and lag phase

表4 二級(jí)模型統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table 4 Statistical analysis results of the secondary model

表4為模型的方差分析結(jié)果，用F統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)二級(jí)模型總體的顯著性。由圖3、圖4和表4可知，溫度與比生長(zhǎng)速率以及延滯期之間存在良好的線性關(guān)系。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以冷鮮豬排骨為研究對(duì)象，研究了0℃～20℃不同恒定溫度時(shí)假單胞菌增殖變化情況，構(gòu)建了假單胞菌在冷鮮排骨上生長(zhǎng)預(yù)測(cè)的一級(jí)模型和二級(jí)模型；通過(guò)計(jì)算準(zhǔn)確因子和偏差因子，得出準(zhǔn)確因子和偏差因子的值均在1左右，表明一級(jí)模型能很好預(yù)測(cè)不同溫度下假單胞菌的生長(zhǎng)，二級(jí)模型中溫度與比生長(zhǎng)速率以及延滯期之間也存在良好的線性關(guān)系，判定系數(shù)分別為0.9934和0.9265。以上說(shuō)明預(yù)測(cè)模型能夠很好的擬合0℃～20℃溫度范圍內(nèi)假單胞菌的生長(zhǎng)。

[1]GILL C O,NEWTEN K G.The development of aerobic spoilage flira on meat stored at chill menperature[J].J Appl Microbiol,1977,43:189-195.

[2]GILL C O,NEWTEN K G.The ecology of bacterial spoilage of fresh meat at chill temperature[J].Meat Sci,1978,2:207-217.

[3]王宏勛，陳振青，陳艷麗.藠頭提取物對(duì)假單胞菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的影響[J].中國(guó)釀造，2012，31（11）：90-93.

[4]劉超群，陳艷麗，王宏勛，等.冷鮮豬肉中熱殺索絲菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立與驗(yàn)證[J].食品科學(xué)，2010，31（18）：86-89.

[5]許 鐘，肖琳琳，楊憲時(shí).羅非魚特定腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型和貨架期預(yù)測(cè)[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，29（4）：540-546.

[6]林 睿，劉 亮，王宏勛.鹵制全鴨不同部位菌相組成比較[J].中國(guó)釀造，2012，31（12）：91-93.

[7]唐曉陽(yáng)，趙 勇，孫曉紅，等.冷卻豬肉中假單胞菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立與驗(yàn)證[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（1）：128-131，134.

[8]林 睿，趙國(guó)嬌，王宏勛.裸裝鹵制全鴨中菌相初步研究[J].中國(guó)釀造，2012，31（7）：93-95.

[9]董慶利.低溫蒸煮香腸中大腸桿菌生長(zhǎng)模型參數(shù)的不確定性研究[J].食品科學(xué)，2010，31（5）：5-8.

[10]張立奎，陸兆新.NaCl處理鮮切生菜中大腸菌群數(shù)的預(yù)測(cè)模型研究[J].食品科學(xué)，2004，25（7）：67-71.

[11]GILLCO,GREERGG,DILTSBD.Theaerobic growth ofAeromonas hydrophilaandListeria monocytogenesin brothsand on pork[J].Int J Food Microbiol,1997,35(1):67-74.

[12]GB 4789.2-2008.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定[S].

[13]GB/T 5009.44-2003.肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S].

[14]ZWIETERING M H,JONGENBERGER I,ROMBOUTS F M,et al.Modeling of the bacterial growth curve[J].Appl Environ Microb,1990,56(6):1875-1881.

[15]董慶利，屠 康，李保國(guó)，等.平方根模型在亞硝酸鹽抑菌預(yù)測(cè)中的探討研究[J].食品工業(yè)科技，2009，30（7）：161-164.