鄭新宇，周學(xué)酬，鄭舒燕，蘇 妍，鄭麗輝，林瑞余*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州350002;3.福建省職業(yè)病與化學(xué)中毒預(yù)防控制中心，福州350002)

多巴胺(Dopamine，DA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種非常重要的信息傳遞物質(zhì)[1]。腦組織內(nèi)多巴胺神經(jīng)能與多種病癥，如帕金森病、亨丁頓舞蹈癥和多動(dòng)癥等息息相關(guān)[2－4]。目前，測(cè)量DA濃度的方法有滴定法[5]、分光光度法[6]、液相色譜法[7]等。與這些檢測(cè)方法相比，電化學(xué)方法具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為一種重要的分析手段。但由于DA在固體電極上的過(guò)電位較大，因此用未修飾的固體電極對(duì)DA進(jìn)行直接測(cè)定，靈敏度一般較低。經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的電極，能降低過(guò)電位并增加DA的傳質(zhì)速率，可提高測(cè)定DA的靈敏度，因此在DA的測(cè)定中越來(lái)越受到重視[8－9]。目前常見(jiàn)的電極修飾有聚合膜、Nafion膜和碳納米管等[10－13]。其中氨基酸聚合膜廣泛用于制備化學(xué)修飾電極，如半胱氨酸、賴(lài)氨酸、甘氨酸、組氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸、色氨酸、異白氨酸、天冬氨酸等[14]。氨基酸聚合膜修飾電極具有穩(wěn)定性好、使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，被大量應(yīng)用于實(shí)際樣品中多巴胺的分析測(cè)定[8－9，15－16]，提高了檢測(cè)的靈敏度。目前未見(jiàn)4－氨基丁酸(4－ABA)聚合膜修飾電極用于多巴胺測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。本文采用在碳糊中摻入碳納米管制備碳納米管摻雜碳糊電極(CNTPE)，并在電極表面修飾 4－ABA，制成 P－4－ABA/CNTPE，并對(duì)DA進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示DA峰電流大大增加，電位差減小。制備的電極具有簡(jiǎn)單，不易脫落，穩(wěn)定性好及抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

CHI660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)。

采用三電極系統(tǒng):自制的P－4－ABA/CNTPE為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲為輔助電極。PHS－3C型精密酸度計(jì)(上海大普儀器廠(chǎng))用于測(cè)量溶液的pH值。

光譜純石墨粉、碳納米管、液體石蠟、4－ABA購(gòu)自上海國(guó)藥，鹽酸多巴胺(DA)、抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)購(gòu)自中國(guó)生物藥品制品檢驗(yàn)所，鹽酸多巴胺注射液購(gòu)于廣州白云山明興制藥有限公司。其余常用試劑均為分析純以上試劑，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 修飾電極的制備

稱(chēng)取適量的石墨粉，然后加入適量的液體石蠟與適量的碳納米管混合，研磨均勻(時(shí)間5 min)，將此碳糊壓入電極管的頂端凹槽(直徑3 mm，深2 mm)，填充緊密，壓實(shí)，然后在稱(chēng)量紙上打磨光滑。用二次蒸餾水沖洗電極頭，常溫下晾干備用。得到CNTPE。將制備好的 CNTPE置于含有0.02 mol/L 4－ABA 的0.02 mol/L 磷酸緩沖液(pH 5.0)中，在－0.5～2.0 V電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描6圈(掃描速度200 mV/s)，取出用水沖洗干凈，即得 P－4－ABA/CNTPE。上述所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.3 多巴胺測(cè)定方法

取含一定量DA標(biāo)準(zhǔn)液的BR緩沖液(pH 2.0)5 mL于電解池內(nèi)，采用三電極體系在0.2 V～1.2 V電位范圍內(nèi)進(jìn)行 CV掃描。DA在 P－4－ABA/CNTPE上于0.710 V處出現(xiàn)了明顯的氧化峰，在0.604 V處出現(xiàn)還原峰，基于氧化峰峰型好，峰電流大于還原峰，本實(shí)驗(yàn)則采用記錄氧化峰峰電流與DA濃度的關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳糊電極制備

2.1.1 碳納米管的影響

試驗(yàn)中固定石墨粉與液體石蠟的質(zhì)量分別為0.2 g 和 0.1 g，然后分別摻入 0、0.01 g、0.02 g、0.03 g、0.04 g、0.05 g、0.06 g 的碳納米管，研究碳納米管加入量變化時(shí)DA響應(yīng)電流的變化情況，結(jié)果表明，隨著碳納米管加入量的增加，P－4－ABA/CNTPE對(duì)DA的響應(yīng)電流出現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。由于碳納米管具有很大的表面積，摻入碳糊電極可增大電極的電化學(xué)反應(yīng)面積，使多巴胺在電極上的反應(yīng)電流增大。但碳納米管用量過(guò)大，會(huì)吸附更多的液體石蠟，反而不利于增大電極的電化學(xué)反應(yīng)面積，而導(dǎo)致DA的響應(yīng)電流減小。當(dāng)碳納米管量為0.04 g(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.67%)時(shí)，P－4－ABA/CNTPE 對(duì) DA 的響應(yīng)電流最大(如圖1)。因此本試驗(yàn)選擇碳納米管的量占石墨粉與碳納米管總量16.67%。

圖1 碳納米管比例對(duì)DA氧化峰電流的影響

2.1.2 粘合劑的影響

液體石蠟作為CNTPE的粘合劑，為了考察粘合劑的影響。固定碳納米管的量占石墨粉與碳納米管總量16.67%的前提下，逐步改變液體石蠟與石墨粉和碳納米管總量的比例。試驗(yàn)表明，隨著液體石蠟含量的提高，峰電流逐漸減小(如圖2)，但石蠟比例偏小會(huì)導(dǎo)致電極強(qiáng)度變差，碳糊容易脫落。當(dāng)液體石蠟與石墨粉和碳納米管總量的比例為1∶3時(shí)，峰電流較大，機(jī)械強(qiáng)度也較好。所以本試驗(yàn)選擇粘合劑與固體粉末的比例為1∶3。

圖2 粘合劑比例對(duì)DA氧化峰電流的影響

2.2 電聚合條件的影響

2.2.1 聚合底液pH的影響

試驗(yàn)選定磷酸鹽緩沖溶液(PP)作聚合底液，分別試驗(yàn)了pH值為5.0～8.0的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行電聚合，并將聚合后的P－4－ABA/CNTPE對(duì)2.0×10－5mol/L DA進(jìn)行CV掃描。試驗(yàn)結(jié)果得出:不同酸度底液聚合得到的電極對(duì)DA峰電流和峰電位均有影響:隨著底液pH值的不斷增大，響應(yīng)電流不斷減小，氧化峰電位不斷負(fù)移，還原峰電位不斷正移。故實(shí)驗(yàn)選定pH為5.0的PP緩沖溶液作聚合底液。

2.2.2 聚合底液4－ABA濃度的影響

在選定的pH為5.0的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行電聚合，逐步提高底液 4－ABA的濃度，分別為:0.005 mol/L、0.01 mol/L、0.02 mol/L、0.04 mol/L和0.06 mol/L。然后將聚合后的 P－4－ABA/CNTPE電極對(duì)2.0×10－5mol/L DA進(jìn)行CV掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4－ABA的濃度對(duì)聚合后電極的性能有較大的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)4－ABA的濃度過(guò)大時(shí)，所得P－4－ABA/CNTPE電極對(duì)DA的響應(yīng)峰電流較小，測(cè)量重現(xiàn)性較差，這可能是高濃度聚合得到的膜比較致密，表面積下降造成的。但若其濃度過(guò)低，修飾電極對(duì)DA的響應(yīng)電流也很小，這可能是電極表面的聚合物膜覆蓋程度低所致[17]。故實(shí)驗(yàn)選定濃度為0.02 mol/L的4－ABA磷酸緩沖溶液為聚合底液。

圖3 修飾劑濃度對(duì)DA氧化峰電流的影響

2.3 4－ABA在碳納米管摻雜碳糊電極上的電聚合

圖4所示為4－ABA在碳糊電極上的電聚合曲線(xiàn)。在掃描第一圈時(shí)，氧化峰電流較小，峰形不明顯，這可能是因?yàn)殚_(kāi)始時(shí)碳納米管碳糊電極導(dǎo)電性較差引起的。到了第二圈后，峰電流變大，峰形也變好了，這說(shuō)明聚合一圈后，4－ABA在電極表面再聚合變得更容易。因?yàn)榫?－ABA是導(dǎo)電聚合物，第一圈掃描后碳納米管碳糊電極表面修飾了部分聚4－ABA，使電極導(dǎo)電性增強(qiáng)，有利于后續(xù)4－ABA的電聚合。

圖4 4－ABA在修飾電極上的電聚合循環(huán)伏安圖掃速:200 mV/s;圈數(shù):6;電位范圍:－0.5 V ～2.0 V。

2.4 DA在不同電極上的循環(huán)伏安曲線(xiàn)

分別以 CPE(1)、P－4－ABA－CPE(2)、CNTPE(3)、P－4－ABA/CNTPE(4)為工作電極，在 DA 濃度為4.0×10－5mol/L 的 B－R 緩沖液(pH 2.0)中于 0.2 V～1.2 V進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(掃速為200 mV/s)。結(jié)果如圖5所示。在CPE(1)電極上，DA出現(xiàn)了一對(duì)極其微弱的氧化還原峰，峰電流很低;峰型較差，ΔE1=445 mV。對(duì)于摻入碳納米管的CNTPE(3)而言，其氧化峰電流是CPE(1)的1.5倍，還原峰則是CPE(1)的1.8倍，且氧化峰和還原峰均正移，峰電位差減為376 mV，說(shuō)明碳納米管的摻入，增大了電極表面積。P－4－ABA－CPE(2)電極是 CPE(1)電極經(jīng)4－ABA修飾處理得到的，其氧化峰和還原峰電流較CPE(1)電極而言均增大，與此同時(shí)ΔE2也減少為131 mV。把 CNTPE(3)修飾 4－ABA得到的電極P－4－ABA/CNTPE(4)對(duì)DA進(jìn)行測(cè)定，電極響應(yīng)電流為變?yōu)樵瓉?lái)的2.4倍，電位差變?yōu)?06 mV。比較上述四種電極對(duì)DA的循環(huán)伏安曲線(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)P－4－ABA/CNTPE(4)電極對(duì)DA的響應(yīng)電流最大，峰形最佳，峰電位差最小。本實(shí)驗(yàn)采用該電極作為工作電極，建立檢測(cè)DA的方法。

圖5 DA在各種電極上的循環(huán)伏安圖掃速:200 mV/s。

2.5 掃描速率的影響

在掃速 10 mV/s～600 mV/s下對(duì)含 1.0×10－4mol/L的DA在0.02 mol/L、pH 2.0的 BR 緩沖溶液中進(jìn)行線(xiàn)性伏安掃描(如圖6)，隨著掃速v的增加，DA的氧化峰峰電位逐漸正移，還原峰峰電位逐漸負(fù)移。其氧化峰電流和還原峰電流與掃速的平方根呈線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程分別為 ip=2.515 8 V1/2－1.057 6，R2=0.994 8，ip=2.502 5 V1/2－2.548 6，R2=0.992 7。由此可見(jiàn)，DA在P－4－ABA/CNTPE上的電化學(xué)反應(yīng)是受擴(kuò)散控制的[18]。

圖6 DA在修飾電極上的線(xiàn)性?huà)呙璺矆D

2.6 富集時(shí)間的選擇

濃度為4.0×10－5mol/L 的 DA，在 pH 2.0 的 BR緩沖介質(zhì)中，以修飾電極為工作電極，分別靜置富集2 s、5 s、10 s、20 s、30 s，結(jié)果表明，靜置時(shí)間為 10 s時(shí)，峰電流即達(dá)最大。因此試驗(yàn)選擇靜置10 s后，再進(jìn)行CV掃描。

2.7 修飾電極的重現(xiàn)性

對(duì)4.0×10－5mol/L的DA進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定，峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為4.13%。這表明該P(yáng)－4－ABA/CNTPE對(duì)DA的測(cè)定具有良好的重現(xiàn)性。同樣研究了該修飾電極的穩(wěn)定性，將該修飾電極放置10 d后，再對(duì)相同濃度的DA進(jìn)行測(cè)量，峰電流值僅下降5.23%，表明該P(yáng)－4－ABA/CNTPE具有較好的穩(wěn)定性。

2.8 DA在修飾電極上的線(xiàn)性范圍和檢測(cè)限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，利用循環(huán)伏安法(CV)對(duì)DA進(jìn)行測(cè)定。發(fā)現(xiàn)DA氧化峰電流與其濃度在8.0×10－5～5.3×10－7mol/L 內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為 ip=0.087 3C+0.451 6(ip為峰電流/μA，C 為濃度/μmol/L，R2=0.9941)，檢測(cè)限為2.0×10－7mol/L。

2.9 干擾實(shí)驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)4.0×10－5mol/L的DA溶液進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)相對(duì)誤差＜5%時(shí)，100倍的檸檬酸，10倍的酒石酸，50倍的葡萄糖，400倍的氯化鈉、氯化鉀和200倍的氯化鈣不干擾測(cè)定。

對(duì)2.0×10－5mol/L 的 DA 和 2.0×10－3mol/L 的AA、2.0×10－5mol/L的UA存在的混合液中進(jìn)行CV 掃描。試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，AA、DA和UA的電位分別為0.405、0.710、0.835V，100 倍的 AA 以及同等濃度的UA的存在并不干擾DA的測(cè)定。三者可以明顯分離開(kāi)，說(shuō)明P－4－ABA/GCE電極對(duì)DA具良好的選擇性，可在AA和UA存在的溶液中對(duì)DA進(jìn)行測(cè)定。

圖7 AA，DA和UA在修飾電極上的循環(huán)伏安圖

2.10 樣品的測(cè)定及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

量取1 mL鹽酸多巴胺注射液(標(biāo)示濃度為10 g/L，2 mL/支)先用蒸餾水稀釋100倍，后量取1 mL該稀釋液于100 mL棕色容量瓶中，用pH 2.0的BR緩沖溶液定容，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。將一男性志愿者的尿樣，用pH 2.0的BR緩沖溶液稀釋200倍后，采用P－4－ABA/CNTPE進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。從表1、表2可以看出，兩種實(shí)際樣品的回收率分別在87.50% ～104.26%和92.30% ～97.04%之間，說(shuō)明該方法可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

表1 鹽酸多巴胺注射液測(cè)定結(jié)果(n=5)

表2 實(shí)際尿樣測(cè)定結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

本文制備的P－4－ABA/CNTPE修飾電極，對(duì)DA具有良好的電催化作用，可較大程度提高DA檢測(cè)的靈敏度。P－4－ABA/CNTPE制作簡(jiǎn)單、成本低廉、穩(wěn)定性好，在用于鹽酸多巴胺注射液和人體實(shí)際尿樣的測(cè)定時(shí)，結(jié)果令人滿(mǎn)意。

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