濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 濱州 256603

RNA干擾Apollon基因逆轉(zhuǎn)白血病K562細(xì)胞多藥耐藥

賈秀紅 孝飛飛 李建廠

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 濱州 256603

背景與目的：Apollon基因在白血病等多種腫瘤內(nèi)高表達(dá)。本試驗(yàn)通過構(gòu)建高效干擾Apollon基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表達(dá)載體，探討RNA干擾技術(shù)能否逆轉(zhuǎn)人髓系白血病K562細(xì)胞多藥耐藥。方法：構(gòu)建靶向Apollon基因真核表達(dá)載體pGPHI-GFP-Neo-Apollon，應(yīng)用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，G418穩(wěn)定篩選。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法、細(xì)胞免疫熒光法分別檢測(cè)重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后Apollon mRNA及蛋白的表達(dá)情況；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后對(duì)長春新堿(leurocristine，VCR)、足葉乙苷(etoposide，VP16)的敏感性及凋亡率的變化。結(jié)果：成功構(gòu)建了pGPHI-GFP-Neo-Apollon載體并在K562細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，經(jīng)G418篩選后，重組載體能有效沉默Apollon的表達(dá)，Apollon mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯下降。MTT結(jié)果顯示，基因干擾組細(xì)胞對(duì)VCR、VP16的敏感性明顯增強(qiáng)，其半數(shù)抑制濃度(half-inhibitory，IC50)值分別為(0.144±0.018)mg/L、(17.336±3.571) mg/L，明顯低于細(xì)胞對(duì)照組(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，基因干擾組細(xì)胞聯(lián)合化療藥物后細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論：pGPHI-GFP-Neo-Apollon載體能顯著增強(qiáng)VCR和VP16對(duì)白血病K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，提高K562細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提示RNA干擾Apollon基因表達(dá)能一定程度逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞的多藥耐藥。

白血病；RNA干擾；Apollon基因；多藥耐藥性；細(xì)胞凋亡；K562細(xì)胞

白血病是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，以聯(lián)合化療為主的綜合治療方法仍然是目前最有效的治療方法，但多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一［1］?；熕幬餁[瘤細(xì)胞的基本方式是誘導(dǎo)其凋亡［2］。細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，在機(jī)體發(fā)育、分化和維持體內(nèi)平衡中起著十分重要的作用，凋亡受抑制將導(dǎo)致細(xì)胞生存期延長，利于轉(zhuǎn)化突變的細(xì)胞無限增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族是近年來發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的內(nèi)源性凋亡抑制因子，目前共發(fā)現(xiàn)8個(gè)成員：XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、Apollon、Livin、Survivin、ILP-2，Apollon(BRUCE/ BIRC6，BIR-containing protein 6)是IAPs家族中分子量最大的成員，其轉(zhuǎn)錄的Apollon蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為530×103，含有一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域(桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列)和一個(gè)泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBC)。Apollon是內(nèi)源性IAPs家族成員之一，在白血病細(xì)胞中高表達(dá)，尤其在白血病誘導(dǎo)無緩解、WBC＞10×109/L、復(fù)發(fā)、死亡患者中高表達(dá)，Apollon高表達(dá)的患者骨髓及外周血白血病細(xì)胞清除率及3年無復(fù)發(fā)生存率較低，預(yù)后差。目前研究表明，Apollon抑制凋亡主要通過結(jié)合Smac、HtrA2以及caspase等機(jī)制發(fā)揮作用［3］。白血病細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)是其產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建shRNA真核表達(dá)載體下調(diào)人髓系白血病細(xì)胞株K562中Apollon基因的表達(dá)，檢測(cè)K562細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性及凋亡率的變化，探討白血病細(xì)胞MDR產(chǎn)生的機(jī)制及Apollon作為基因聯(lián)合藥物為治療靶點(diǎn)的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562(濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子遺傳研究所保存)；RPMI-1640、胎牛血清購自美國Hyclone公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展公司；RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司(RNAiso plus)；Apollon及β-actin引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；靶向Apollon的siRNA序列、陰性對(duì)照siRNA序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；一抗兔抗人Apollon多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；二抗TRITC帶有紅色熒光標(biāo)記購自上海江萊生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 pGPHI-GFP-Neo-Apollon載體構(gòu)建及鑒定

前期試驗(yàn)從3條化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)序列中篩選出針對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫人Apollon(ID：57448)的特異性有效siRNA序列(順義鏈：5’-CUGCCUCUUUCAGGCAAUATT-3’，反義鏈：5’-UAUUGCCUGAAAGAGGCAGTT-3’)。根據(jù)其合成一段互補(bǔ)且能編碼相應(yīng)shRNA的雙鏈寡核苷酸。陰性對(duì)照siRNA序列的順義鏈為：5’-GTTCTCCGAACGTGTC ACGTCAAG-3’，反義鏈：5’-GATTACGTGAC ACGTTCGGAGAATT-3’，與人類所有基因無同源性。按上述序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。質(zhì)粒pGPHI-GFP-Neo-Apollon中還帶有綠色熒光蛋白GFP基因作轉(zhuǎn)染標(biāo)記及卡那霉素抗性基因，HI為RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子。shRNA模板的退火：選取濃度為100 μmol/L的2條寡核苷酸鏈各5 μL與退火緩沖液5 μL混勻，加雙蒸水補(bǔ)足體積50 μL，退火程序：95 ℃ 5 min，85 ℃5 min，75 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。重組載體的線性化：BbsⅠ+BamHⅠ 37 ℃酶切1 h，膠回收線性化空載體。T4DNA連接酶連接目的片段與線性化空載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH50α，使用含卡那霉素的平皿篩選，挑取陽性菌落提取質(zhì)粒，用BamHⅠ、PstⅠ限制酶分別做酶切鑒定，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示插入片段正確。用質(zhì)粒中量提取試劑盒提取高純度質(zhì)粒備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細(xì)胞株篩選

用含10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素終濃度均為100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)K562細(xì)胞。細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)生長，于對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分3組：實(shí)驗(yàn)組(用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pGPHI-GFP-Neo-Apollon)、陰性對(duì)照組(用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒)、細(xì)胞對(duì)照組(只加等量無抗生素、無血清培養(yǎng)基)。取對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板，按LipofectamineTM2000說明書將脂質(zhì)體分別與質(zhì)粒在無血清、無抗生素培養(yǎng)液中混合配成轉(zhuǎn)染液轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染12 h后加入G418(400 μg/mL)篩選，每2 d半量換液1次并重新加入G418，維持此濃度篩選4周，挑取單克隆細(xì)胞，用G418(200 μg/mL)培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞株分別命名為K562/ahNC和K562/shApollon。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)Apollon mRNA的表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長期的K562細(xì)胞以3 ×105/孔接種于6孔培養(yǎng)板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，作為細(xì)胞對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組采用前期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種于6孔板，每組2孔，于24 h后提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品吸光度(A)比值(A260/A280)，介于1.8～2.2。兩步法行RT-PCR。由Primer Premier軟件設(shè)計(jì)并化學(xué)合成Apollon引物序列順義鏈：5’-TGGCTCAAGCTGGATTTTAT-3’，反義鏈：5’-TTCAGACCAAGGTTCATCAG-3’，擴(kuò)增長度116 bp。內(nèi)參照β-actin序列順義鏈：5’-TCATGTTTGAGACCTTCAA-3’，反義鏈5’-GTCTTTGCGGATGTCCACG-3’，擴(kuò)增片段513 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃模板變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)含EB的10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，采集圖像，經(jīng)Bandleader軟件分析圖像，計(jì)算出目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平：以Apollon/β-actin灰度比值(ODR)表示。

1.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)pGPHI-GFP-Neo-Apollon載體對(duì)K562 Apollon蛋白表達(dá)的影響

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGPHI-GFP-Neo-Apollon載體、陰性載體、未轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液滴在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，把載玻片放入24孔板，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出細(xì)胞爬片，經(jīng)4%多聚甲醛固定，1%的Triton穿孔，2%的BSA封閉30 min，加入一抗4 ℃過夜(1∶100)，加入熒光二抗TRITC(1∶120)，避光、室溫反應(yīng)1 h，PBS漂洗，50%緩沖甘油封片，激光共聚焦拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。參照Image ProPlus 6.0專業(yè)圖像分析軟件測(cè)定細(xì)胞熒光強(qiáng)度，將熒光圖片轉(zhuǎn)成灰度圖片，測(cè)量其光密度(IOD)和總面積數(shù)值，利用IOD與總面積的比值計(jì)算灰度圖片紅色熒光區(qū)域的平均灰度(熒光強(qiáng)度)數(shù)值，所得熒光強(qiáng)度數(shù)值用“”表示。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率變化

取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分3組：實(shí)驗(yàn)組(K562/shApollon)、陰性對(duì)照組(K562/shNC)和細(xì)胞對(duì)照組(K562)；每組均設(shè)未加藥組、長春新堿(lenrocristins，VCR)組和足葉乙苷(etoposide，VP16)組，VCR和VP16質(zhì)量濃度分別為0.01 μg/mL和5 μg/mL。加藥48 h后，收集上述各組細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次后將細(xì)胞重懸于100 μL的Binding Buffer，分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC、5 μL PI，室溫避光染色10 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 MTT法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的變化

取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL細(xì)胞懸液中含1×104個(gè)細(xì)胞。3組細(xì)胞加入不同濃度的VCR及VP16，VCR終質(zhì)量濃度為0、0.01、0.1、1.0、10、100 μg/mL，VP16終質(zhì)量濃度為0、0.05、0.5、5.0、50和500 μg/mL，每種細(xì)胞每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于加藥48 h后加入5 g/L的MTT 20 μL，溫育4 h后離心棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩15 min，待紫色結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長處A值。各平行孔取平均值，計(jì)算各組細(xì)胞對(duì)VCR、VP16的細(xì)胞增殖抑制率(IR)，IR=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。根據(jù)各藥物不同濃度的IR，通過計(jì)算軟件獲得半數(shù)抑制濃度(half-inhibitory，IC50)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 重組載體pGPHI-GFP-Neo-Apollon的酶切鑒定及測(cè)序

原始載體多克隆位點(diǎn)處有PstⅠ，插入目的序列后PstⅠ被替換，插入的目的序列中帶有BamHⅠ，所以陽性重組載體應(yīng)該可以被BamHⅠ切開，而不能被PstⅠ切開。shRNA序列：5’-CACCGCTGCCTCTTTCAGGCAATAT TCAAGAGATATTGCCTGAAAGAGGCAGTTT TTTG-3’，測(cè)序結(jié)果顯示重組載體的插入順序正確。

2.2 重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞對(duì)Apollon mRNA表達(dá)水平的影響

篩選4周后收集各組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示各組均可檢測(cè)到β-actin及Apollon mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組Apollon mRNA的表達(dá)水平明顯降低，其相對(duì)表達(dá)量為(27.622±0.057)%，與細(xì)胞對(duì)照組［(89.770±0.028)%]和陰性對(duì)照組［(84.868±0.057)%]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.936，t=13.771，P＜0.05)，而細(xì)胞對(duì)照但和陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果表明，pGPHI-GFP-Neo-Apollon重組載體轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞后Apollon基因被穩(wěn)定抑制，成功構(gòu)建了重組載體穩(wěn)定表達(dá)的K562細(xì)胞株(圖1)。

圖 1 RT-PCR鑒定pGPHI-GFP-Neo-Apollon穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞中Apollon mRNA的表達(dá)水平Fig. 1 Apollon gene expression in K562 cells transfected with pGPHI-GFP-Neo-Apollon was detected by RT-PCR

2.3 重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞對(duì)Apollon 蛋白表達(dá)水平的影響

穩(wěn)定篩選4周后收集各組細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞Apollon蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Apollon蛋白的熒光強(qiáng)度為(15.96±1.71)%，明顯低于細(xì)胞對(duì)照組［(35.36±2.90)%］和陰性對(duì)照組［(34.97±2.65)%］(t=8.34，t=7.82，P＜0.05)，而細(xì)胞對(duì)照組和陰性對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率的變化

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，未加化療藥物時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于細(xì)胞對(duì)照組及陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而K562組和K562/shNC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。加入化療藥物VCR和VP16作用48 h后，K562/shApollon組細(xì)胞凋亡率較未加藥物明顯升高，并且顯著高于相同藥物作用的K562組和K562/shNC組(P＜0.05)，K562組和K562/ shNC組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1，圖3)。

2.5 重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞對(duì)VCR和VP16的敏感性變化

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，K562/shApollon細(xì)胞組VCR和VP16的IC50值明顯低于未轉(zhuǎn)染的正常對(duì)照組K562細(xì)胞組(P＜0.05)，而正常對(duì)照組K562細(xì)胞及陰性對(duì)照K562/shNC細(xì)胞組的IC50值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。結(jié)果說明，pGPHI-GFP-Neo-Apollon重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染即Apollon基因表達(dá)被抑制后，K562細(xì)胞對(duì)VCR和VP16的敏感性增強(qiáng)。

圖 2 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Apollon 蛋白的表達(dá)水平Fig. 2 Apollon protein expression level detected by cell immunofluorescence

表 1 RNA干擾Apollon基因表達(dá)后K562細(xì)胞對(duì)VCR和VP16的敏感性(IC50)及凋亡率變化Tab. 1 Effects of RNA interference targeting Apollon gene on the drug-sensitivity (IC50) and apoptotic rate of K562 cells to VCR or VP16

3 討 論

MDR是指腫瘤細(xì)胞接觸一種腫瘤藥物并產(chǎn)生耐藥性后，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種抗腫瘤藥物具有交叉耐藥性。MDR是腫瘤細(xì)胞耐藥的常見方式，也是臨床腫瘤化療失敗的主要原因之一。目前，以化療為主的綜合治療仍然是治療白血病的主要方法，作為臨床治療白血病的一線藥物生物堿類抗腫瘤藥物(VCR)、鬼臼毒素類(VP16)等能特異性作用于不同的細(xì)胞周期，但易發(fā)生MDR，本實(shí)驗(yàn)以VCR、VP16為研究藥物，為逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞MDR尋找新的有效基因靶點(diǎn)。

圖 3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組聯(lián)合不同化療藥物處理K562細(xì)胞的凋亡情況Fig. 3 Apoptosis of K562 cells after different transfections combined with chemotherapeutics was detected by flow cytometry.

Apollon是目前發(fā)現(xiàn)的重要凋亡抑制因子之一，其高表達(dá)影響細(xì)胞凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后方面都發(fā)揮重要作用，尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的表達(dá)明顯增高，如白血病、淋巴瘤等。白血病細(xì)胞凋亡受阻會(huì)帶來嚴(yán)重的臨床問題，使其對(duì)放化療等多種治療方法不敏感。在兒童ALL中，往髓鞘或靜脈注射多種化療藥物，于第7天對(duì)早期化療誘導(dǎo)效果進(jìn)行評(píng)估，大部分患者未能達(dá)到完全誘導(dǎo)緩解，在未完全誘導(dǎo)緩解患者中都有Apollon基因高表達(dá)，能誘導(dǎo)緩解的患者Apollon基因表達(dá)較低，推測(cè)Apollon可能與腫瘤耐藥有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在Apollon高表達(dá)的細(xì)胞中，由于Apollon與caspase-9作用而抑制了依托泊苷對(duì)caspase-9的激活，表現(xiàn)出對(duì)依托泊苷的耐藥性［4］。Apollon高表達(dá)與細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)有關(guān)，抑制其表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡能力，提高對(duì)藥物的敏感性。Lopergolo等［5］通過RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞Apollon基因表達(dá)，能減緩乳腺癌的進(jìn)度，Apollon基因介導(dǎo)的凋亡機(jī)制還與P53基因和Caspase-3的激活密切相關(guān)，基因聯(lián)合化學(xué)療法也許能提供治愈腫瘤的方法，為靶向藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。Kelly等［6］研究表明，表達(dá)Apollon抑制因子可導(dǎo)致MLN8237劑量依賴性降低，并引起與Aurora A抑制因子一致的形態(tài)學(xué)表型，敲除Apollon后，使CML細(xì)胞對(duì)尼羅替尼誘導(dǎo)凋亡的敏感性增強(qiáng)，提示Apollon在MLN8237增強(qiáng)尼羅替尼療效方面可能是一個(gè)潛在的重要因子。Tassi等［7］研究表明，黑素瘤對(duì)細(xì)胞毒性藥物、靶向抑制因子導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的敏感性與Apollon蛋白的下行性調(diào)節(jié)有關(guān)，應(yīng)用小干擾RNA (small interference RNA，siRNA)作用于Apollon，明顯增強(qiáng)了細(xì)胞毒性藥物、MEK及BRAF V600E抑制因子導(dǎo)致的Caspase依賴的黑素瘤凋亡及TRAIL的溶解。RNAi技術(shù)是一種高效的基因阻斷技術(shù)，利用RNAi逆轉(zhuǎn)白血病MDR已在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，Yague等［8］應(yīng)用靶向MDR基因1(multi-drug resistance gene1，MDR1)的RNAi技術(shù)降低MDR1 mRNA和膜糖蛋白P-gp的表達(dá)，通過逆轉(zhuǎn)K562細(xì)胞的MDR表型來逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥，提示RNAi的目的序列整合到基因治療載體將在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。

最近的研究表明，在兒童初治AML中，Apollon高表達(dá)與患兒最初的臨床特征有關(guān)，如白細(xì)胞計(jì)數(shù)高和有髓外疾病的患兒Apollon表達(dá)水平相對(duì)較高，并且Apollon高表達(dá)誘導(dǎo)化療療效差，同時(shí)3年無復(fù)發(fā)生存率低，總生存期短［9-10］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Apollon基因真核表達(dá)載體，經(jīng)G418篩選重組載體穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)組Apollon mRNA相對(duì)表達(dá)量［(27.622±0.057)%］及Apollon蛋白相對(duì)表達(dá)量［(15.96±1.71)%］明顯低于細(xì)胞對(duì)照組及陰性對(duì)照組，表明pGPHI-GFP-Neo-Apollon重組載體能有效沉默Apollon基因表達(dá)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，Apollon-shRNA重組載體可顯著降低K562細(xì)胞對(duì)VCR、VP16的IC50值(P＜0.05)，表明Apollon基因被沉默后，K562細(xì)胞對(duì)VCR及VP16的敏感性增強(qiáng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，沉默Apollon基因表達(dá)聯(lián)合化療藥物作用后細(xì)胞凋亡率明顯提高(P＜0.05)，提示下調(diào)Apollon表達(dá)能促進(jìn)VCR、VP16誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，這與Pennati等［4］通過siRNA介導(dǎo)的Apollon下調(diào)可使腫瘤細(xì)胞更易于發(fā)生由抗癌藥物所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的研究相一致。

本研究初步證實(shí)了靶向Apollon基因真核表達(dá)載體可有效抑制K562細(xì)胞中Apollon的表達(dá)，沉默該基因可顯著提高K562細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。因此，Apollon基因高表達(dá)增強(qiáng)了白血病細(xì)胞抗凋亡能力，應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默Apollon基因表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)白血病MDR，引導(dǎo)研究者可考慮將Apollon基因作為新的治療靶點(diǎn)。

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《中國癌癥雜志》舉辦繼續(xù)教育函授班通知

經(jīng)本刊編委會(huì)討論決定，本刊從2013年下半年起舉辦2014年度繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育函授班：

一、2013年第8期起開設(shè)2014年度函授繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育專欄，本年度的主要內(nèi)容包括：胰腺癌、食管癌、胃癌的病理診斷、放射治療及內(nèi)外科治療等。每期刊登1講，共12講，2014年第8期刊登考試試題，第9期刊登正確答案，要求學(xué)員認(rèn)真閱讀講座后答題，并將答案寄至編輯部（復(fù)印無效），考卷經(jīng)專人統(tǒng)一審閱，合格者授予Ⅱ類繼續(xù)教育學(xué)分10分，學(xué)分證書由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頒發(fā)。

二、參加對(duì)象：所有正在從事醫(yī)學(xué)專業(yè)技術(shù)工作的衛(wèi)生技術(shù)人員。預(yù)參加者請(qǐng)寫好本人姓名、年齡、性別、職稱、職務(wù)、學(xué)歷、選派單位名稱（地址及郵政編碼）、所在科室、聯(lián)系電話等寄往本編輯部（E-mail：zgaz@chinajournal.net.cn；zgazzz@163.com），同時(shí)通過郵局匯款（單位名稱：《中國癌癥雜志》編輯部；地址：上海市徐匯區(qū)東安路270號(hào)）的方式支付函授教育費(fèi)，并請(qǐng)?jiān)趨R款備注中注明“2014年度函授繼續(xù)教育”。編輯部收到學(xué)員報(bào)名和函授教育費(fèi)后編號(hào)登記注冊(cè)，隨即寄出注冊(cè)費(fèi)發(fā)票，并按時(shí)寄上每期刊物。即日起開始報(bào)名。

三、學(xué)員每人收費(fèi)200元，贈(zèng)送12期雜志。編輯部依據(jù)學(xué)員報(bào)名登記注冊(cè)編號(hào)、交費(fèi)記錄和考試成績(jī)于2014年10月30日以前寄發(fā)學(xué)分證書。

四、編委會(huì)邀請(qǐng)有關(guān)專家進(jìn)行出題、閱卷工作，并設(shè)專人負(fù)責(zé)。電話：021-64188274；傳真：021-64043766；郵編：200032；聯(lián)系人：王露。歡迎廣大醫(yī)務(wù)人員踴躍參加。

Reversion of multidrug resistance in leukemia K562 cells by RNA interference targeting Apollon gene

JIA Xiu-hong, XIAO Fei-fei, LI Jian-chang (Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou Shandong 256603, China)

JIA Xiu-hong E-mail: jiaxiuhong001@163.com

Background and purpose: Apollon gene is highly expressed in leukemia and other tumors. The study aimed to discuss whether RNAi technology can reverse multidrug resistance of chronic myeloid leukemia cell line K562 through constructing a eukaryotic vector of short hairpin RNA (shRNA) targeting at Apollon gene. Methods: The eukaryotic vector pGPHI-GFP-Neo-Apollon with shRNA targeting at Apollon gene was constructed and then transfected into K562 cells by LipofectamineTM2000, and G418 pressure selection. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunofluorescence were used to detect the expression of Apollon mRNA and protein after Apollon was transfected stably in K562 cells. The changes of sensitivity of K562 cells to leurocristine (VCR) and etoposide (VP16) after transfection with shRNA-Apollon were detected by MTT method, and the apoptosis rate was detected by flow cytometry. Results: pGPHI-GFP-Neo-Apollon carrier was constructed successfully and expressed stably in K562 cells, and after G418 screening, it silenced Apollon mRNA and protein expression effectively. According to the result of MTT, the sensitivity of K562 cells to VCR and VP16 increased significantly in the group of gene interference, with half of its inhibition concentration (half-inhibitory, IC50) value significantly lower than the control group (P＜0.05); Flow cytometry showed that the cell apoptosis rate was increased significantly (P＜0.05), but there was no statistically significant difference in the apoptosis rate between shRNA negative control group and normal control group (P＞0.05). Conclusion: pGPHI-GFP-Neo-Apollon carrier can enhance the abilities of VCR and VP16 to inducethe apoptosis of K562 cells, namely an increase of sensitivity to these chemotherapeutics in K562 cells, it is hinted that RNA interference targeting Apollon gene may reverse the multidrug resistance of leukemia cells in some degree.

Leukemia; RNA interference; Apollon genes; Multiple drug resistance; Apoptosis; K562 cells

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.09.004

R733.7

：A

：1007-3639(2013)09-0713-08

2013-04-24

2013-08-05 ）

山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No：2010GSF10264)。

賈秀紅 E-mail:jiaxiuhong001@163.com