馬曉羅曉瑩李宗海李鶴成

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院上海市腫瘤研究所，上海 200032

分泌型簇集素蛋白在肺癌細(xì)胞株中生物學(xué)行為的研究

馬曉1羅曉瑩2李宗海2李鶴成1

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院上海市腫瘤研究所，上海 200032

背景與目的：簇集素蛋白(clusterin，CLU)在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究用分泌型CLU體外處理肺癌細(xì)胞株，旨在探討分泌型CLU對(duì)肺癌細(xì)胞株的影響。方法：用真核表達(dá)純化的分泌型CLU處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460、A549，采用Boyden小室試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，用CCK8檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，利用芯片技術(shù)分析CLU處理H460細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)分泌型CLU處理H460細(xì)胞中microRNA的表達(dá)，初步分析分泌型CLU執(zhí)行腫瘤生物學(xué)功能的microRNA相關(guān)分子機(jī)制。結(jié)果：分泌型CLU處理組H460遷移的細(xì)胞是BSA處理組的3.10倍(P＜0.000 1)；分泌型CLU處理組A549遷移的細(xì)胞是BSA處理組的3.40倍(P＜0.000 1)；分泌型CLU抑制了肺癌細(xì)胞株H460/A549的生長(zhǎng)(P＜0.000 1)；利用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)microRNA-302b-3p、microRNA-23a-5p和microRNA-101-5p高表達(dá)。結(jié)論：在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460/A549中，真核表達(dá)的分泌型CLU促進(jìn)了細(xì)胞遷移、抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，并且能引起microRNA表達(dá)譜的改變，本研究為探索分泌型CLU在非小細(xì)胞肺癌中的作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

分泌型簇集素蛋白；非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞遷移；microRNA

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康和生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年因肺癌死亡的患者有140萬，約占所有惡性腫瘤死亡的18%［1］。相關(guān)研究顯示，腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、無限增殖及凋亡調(diào)控失衡參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［2］。肺癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步發(fā)展的復(fù)雜過程，包括原癌基因的活化、抑癌基因的失活等，其中細(xì)胞增殖和凋亡之間的失衡是重要的因素。

簇集素蛋白(clusterin，CLU)是一個(gè)廣泛糖基化的蛋白，其生物學(xué)意義仍然存在爭(zhēng)議。CLU在正常成熟組織中低表達(dá)而選擇性的在某些惡性腫瘤中高表達(dá)，如肺癌，前列腺癌，乳腺癌、卵巢癌及宮頸癌等［3］。CLU因能使不同的細(xì)胞聚集而命名［4］，由于選擇性剪接的結(jié)果，其有兩種主要的亞型，多功能分子伴侶分泌型CLU(sCLU)和促凋亡的核型CLU (nCLU)［5］。sCLU開始是一條相對(duì)分子質(zhì)量約60×103的前體多肽，經(jīng)過裂解和糖基化形成了α和β鏈，每條鏈相對(duì)分子質(zhì)量約40×103，并最終形成分泌型異二聚體，相對(duì)分子質(zhì)量約49×103的nCLU在轉(zhuǎn)錄后修飾成相對(duì)分子質(zhì)量約55×103有活性的nCLU，在細(xì)胞核集中，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。CLU在腫瘤中的具體作用機(jī)制還不明確，Sonn等［7］合成純化CLU，研究其在自然殺傷細(xì)胞中的作用。為了探討CLU在肺癌中的作用，本研究采用純化的sCLU體外處理肺癌細(xì)胞株，探討sCLU對(duì)肺癌細(xì)胞株的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM以及胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；CCK8購(gòu)自Invitrogen公司；Boyden Chamber小室購(gòu)自上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司；質(zhì)粒小抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；LipofecamineTM2000、optiDMEM和總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、高保真酶PrimeStarTM、RNA反轉(zhuǎn)試劑盒PrimeScriptTMRT Kit均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。兔抗人Clusterin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；低分子量蛋白marker購(gòu)自上海Sangon公司；MicroRNA表達(dá)試劑盒購(gòu)自廣州銳博公司。

1.2 細(xì)胞、質(zhì)粒菌株及細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌H460、A549細(xì)胞、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pRAG5-flag、HEK-293F細(xì)胞由上海市腫瘤研究所癌基因及相關(guān)基因國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，肺癌細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 真核表達(dá)純化sCLU

利用人肺癌細(xì)胞中提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板，進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物回收構(gòu)建真核表達(dá)載體，將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，涂在含氨芐青霉素(ampicillin)的LB平皿上，次日選取單克隆菌落置于培養(yǎng)液中，在搖床中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，隨后測(cè)序鑒定，得到正確的序列則進(jìn)采用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293F細(xì)胞得到目的蛋白，利用Flag抗體及CLU抗體進(jìn)行純化，鑒定得到純化的sCLU。

1.4 Boyden小室試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分BSA對(duì)照組和sCLU處理組，采用Boyden小室試驗(yàn)檢測(cè)牛血清蛋白BSA對(duì)照組及sCLU處理組H460/A549細(xì)胞的遷移能力，首先Boyden小室上、下室之間用孔徑8 μm的聚碳酸酯膜分開，上室加入含5.4 μmol/L的sCLU及肺癌細(xì)胞H460/A549(5×105個(gè)/mL)的無血清培養(yǎng)基400 μL/室，下室加含有5.4 μmol/L的sCLU完全培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，取出小室，用棉簽擦去上室未穿膜的細(xì)胞；用4%甲醛溶液固定黏附到濾膜下室面的細(xì)胞，蘇木精染色，梯度乙醇溶液逐級(jí)脫水，鄰苯二甲醛透明后，置于載玻片上封固。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野(×100)下的穿膜細(xì)胞數(shù)，以穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞的遷移能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.5 CCK-8 法檢測(cè)sCLU對(duì)H460/A549細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H460及A549細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔板中，100 μL/孔。細(xì)胞培養(yǎng)過夜后分別加入終濃度為5.4 μmol/L的sCLU或者BSA培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每天進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，即吸出上清液，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 μL/孔(其中含10 μL/孔的CCK-8液)；3 h后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處各孔的吸光度(A)值，收集7 d結(jié)果計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 sCLU處理H460細(xì)胞microRNA表達(dá)譜分析

以5.4 μmol/L濃度sCLU處理H460細(xì)胞48 h，收集RNA，委托上?？党晒具M(jìn)行microRNA表達(dá)譜分析，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)分泌型Clusterin處理組H460細(xì)胞中microRNA的表達(dá)

用TRIzol試劑提取sCLU處理組H460細(xì)胞總RNA，隨后利用廣州銳博公司定量PCR檢測(cè)microRNA表達(dá)試劑盒分析。大致如下，取50 ng總RNA加入銳博公司提供的反轉(zhuǎn)錄引物，利用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件：16 ℃30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 10 min。熒光定量PCR反應(yīng)體系中主要包含2×SYBR Green Real-timePCR Master Mix及銳博公司提供的microRNA特異引物，在ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、62 ℃ 60 s ，共40個(gè)循環(huán)。在62 ℃檢測(cè)熒光強(qiáng)度，結(jié)果分析采用2－ΔΔCt方法：ΔΔCt＝實(shí)驗(yàn)組(Ct microRNA－Ct U6)-對(duì)照組(Ct microRNA-Ct U6)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

通過SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 真核表達(dá)純化sCLU

在人肺癌細(xì)胞系H460的cDNA文庫(kù)中利用引物進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，成功構(gòu)建了sCLU真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染進(jìn)293F細(xì)胞7 d后收集培養(yǎng)上清液，取上清液進(jìn)行sCLU抗體純化，最后利用特異型抗體進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)均可被FlAG標(biāo)簽抗體識(shí)別，證明是我們所需要的sCLU。

2.2 sCLU促進(jìn)H460細(xì)胞遷移

在sCLU濃度為5.4 μmol/L情況下，檢測(cè)sCLU對(duì)肺癌細(xì)胞株H460細(xì)胞遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)sCLU能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移(圖1)，sCLU處理組遷移的細(xì)胞是BSA對(duì)照組的3.10倍。

2.3 sCLU促進(jìn)A549細(xì)胞遷移

為了進(jìn)一步檢測(cè)sCLU的功能，我們還在A549細(xì)胞中檢驗(yàn)了sCLU對(duì)細(xì)胞遷移的影響，發(fā)現(xiàn)sCLU同樣能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移，sCLU處理組遷移的細(xì)胞是BSA對(duì)照組的3.44倍(圖2)。

2.4 sCLU抑制肺癌細(xì)胞株H460/A549的生長(zhǎng)

研究結(jié)果顯示，sCLU抑制肺癌細(xì)胞株H460/A549細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3)。

2.5 sCLU對(duì)H460細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜

本研究利用芯片探查了microRNA相關(guān)的分子機(jī)制。首先收集了sCLU處理的H460細(xì)胞，抽提RNA，然后進(jìn)行microRNA表達(dá)譜芯片的檢查和生物信息學(xué)分析，取得結(jié)果后使用定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證(圖4A)。根據(jù)芯片結(jié)果，sCLU與BSA處理H460細(xì)胞中microRNA表達(dá)具有明顯的相關(guān)性(圖4B)，主要分布于對(duì)稱軸附近，但較多的microRNA被sCLU誘導(dǎo)高表達(dá)(位于對(duì)角線平行兩條斜線之外)，因此高表達(dá)microRNA是研究的目標(biāo)。根據(jù)芯片分析，本研究選擇了8個(gè)microRNA作為備選的microRNA(圖4C)。

2.6 sCLU引起microRNA表達(dá)變化

根據(jù)芯片提示，本研究使用定量PCR方法，對(duì)目標(biāo)microRNA表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)我們確定的8個(gè)目標(biāo)microRNA，其中3個(gè)microRNA表達(dá)，而且與BSA處理的樣本差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

圖 1 sCLU促進(jìn)H460細(xì)胞遷移Fig. 1 sCLU promoted migration in H460

圖 2 sCLU促進(jìn)A590細(xì)胞遷移Fig. 2 sCLU promoted migration in A549

圖 3 sCLU抑制H460/A549細(xì)胞生長(zhǎng)Fig. 3 sCLU (secretory clusterin) inhibited the growth of lung cancer cells

圖 4 sCLU處理組H460細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜式分析Fig. 4 The analysis of microRNA expression spectrum in H460 treated with secretory clusterin

圖 5 microRNA-302b-3p、microRNA-23a-5p和microRNA-101-5p高表達(dá)Fig. 5 microRNA-302b-3p, microRNA-23a-5p and microRNA-101-5p overexpressed in H460

3 討 論

本研究前期的實(shí)驗(yàn)證明上調(diào)nCLU的表達(dá)具有明顯抑制腫瘤增殖的作用，并且可以使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移和侵襲能力明顯減弱。Bettuzzi等［8］認(rèn)為sCLU對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖沒有作用，而Matsuda等［9］的研究顯示sCLU能降解細(xì)胞基質(zhì)，可作為Ⅵ膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(membrane-type 6 matrix metalloproteinase，MT6-MMP)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，對(duì)于腫瘤的侵襲起到重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，在肺癌細(xì)胞A549中，sCLU處理組遷移的細(xì)胞是BSA對(duì)照組的3.44倍；在肺癌細(xì)胞H460中，則是BSA對(duì)照組的3.10倍。因此可以得出sCLU對(duì)于肺癌細(xì)胞的遷移同樣存在促進(jìn)作用。隨后CCK-8檢測(cè)結(jié)果也顯示sCLU抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

蛋白組學(xué)在癌癥的研究中起到重要作用［10］，microRNA是其中的一種方法，越來越多的研究表明，microRNA通過與靶基因的相互作用，調(diào)控人類至少1/3基因的表達(dá)，在生理和病理過程中有重要作用［11］，生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新技術(shù)，具有高通量、高集成、微型化、連續(xù)化和自動(dòng)化的特點(diǎn)，此技術(shù)現(xiàn)已成熟運(yùn)用到mRNA 水平基因表達(dá)檢測(cè)上，是檢測(cè)細(xì)胞或組合microRNA表達(dá)譜的理想方法［12］。sCLU在肺癌細(xì)胞中具有明顯的功能，但其分子機(jī)制還不清楚，本研究利用芯片技術(shù)探查了microRNA的分子。結(jié)果顯示部分microRNA可能參與了肺癌發(fā)生的分子機(jī)制。對(duì)于microRNA，Liu等［13］在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)MicroRNA-449a能夠增強(qiáng)放療的敏感性。Miao等［14］發(fā)現(xiàn)microRNA-449c能抑制非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展。Kuo等［15］發(fā)現(xiàn)MicroRNA-33a可作為肺癌中骨轉(zhuǎn)移的抑制因子。本研究中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的microRNA可能通過某些特殊機(jī)制與sCLU相互作用，為后續(xù)研究提供了重要的依據(jù)。

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The study of secretory clusterin on the biological behaviors of non-small cell lung cancer cells

MA Xiao1, LUO Xiao-ying2, LI Zong-hai2, LI He-cheng1(1.Department of Thoracic Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Shanghai Cancer Institute, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200032, China)

LI He-cheng E-mail: lihecheng2000@hotmail.com

Background and purpose: Primary study showed that clusterin was associated with tumorigenicity. The goal of the study is to investigate the role of secretory clusterin in non-small cell lung cancer cell A549/H460. Methods: The lung cancer cell A549/H460 was treated with purified secretory clusterin, the Boyden Chamber migration assay was used to detected the migration of the lung cancer cell; the CCK8 assay was used to detected the growth of the cells; microRNA expression spectrum in H460 treated with secretory clusterin was analyzed, after that, we used the real-time florescence quantification detected the expression of microRNA in H460, and the biological function of microRNA molecular mechanisms of secretory clusterin was analyzed. Results: Secretory clusterin promoted the migration in A549/H460 (P＜0.000 1); Secretory clusterin inhibited the growth in H460/A549 (P＜0.000 1); MicroRNA-302b-3p, microRNA-23a-5p and microRNA-101-5p was overexpressed in H460 when treated with secretory clusterin. Conclusion: Secretory clusterin could promote the migration and inhibit the growth of lung cancer cell；It could change the microRNA expression spectrum as well. Our studies revealed that secretory clusterin could be used as a tool for further study, and it is a potential target in the treatment of lung cancer.

Secretory clusterin; Non-small cell lung cancer; Cell migration; MicroRNA

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.09.001

R734.2

：A

：1007-3639(2013)09-0697-06

2013-05-07

2013-07-17）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No：81272608)；上海市科技啟明星跟蹤計(jì)劃(No：11QH1400600)。

李鶴成 E-mail:lihecheng2000@hotmail.com