孟紅旭 姚明江 劉建勛

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100091）

人參皂苷Re對大鼠心室肌細(xì)胞鈉、鉀離子通道的影響

孟紅旭 姚明江 劉建勛

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100091）

目的：觀察人參皂苷Re對大鼠心室肌細(xì)胞電壓依賴性的鈉、鉀離子通道的影響，揭示其抗心律失常的作用機(jī)制。方法：采用酶分法獲得單個(gè)大鼠心室肌細(xì)胞，在全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)模式下，記錄電壓依賴性鈉通道、瞬時(shí)外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道電流，并觀察不同濃度的人參皂苷Re對電流幅度的影響。結(jié)果：給予人參皂苷Re（10，100μmol·L-1）后鈉通道電流幅度呈現(xiàn)減小的趨勢，對通道電流幅度的抑制率分別為（25.5±5.7）%（n＝3）和（46.2±18）%（n＝4）。給予人參皂苷Re（10，100μmol·L-1）對瞬時(shí)外向鉀電流幅度略有抑制，洗脫后電流恢復(fù)，其中100μmol·L-1人參皂苷對電流的抑制率為（13±9）%（n＝3）。給予人參皂苷Re（10，100μmol·L-1）后內(nèi)向整流鉀電流幅度呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，藥物洗脫后電流完全恢復(fù)，（10，100μmol·L-1）對通道電流幅度的抑制率分別為（16.3±8.7）%（n＝5）和（35.4±11.2）%（n＝5）。結(jié)論：人參皂苷Re能夠抑制心室肌細(xì)胞電壓依賴性的鈉通道、瞬時(shí)外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道電流發(fā)揮抗心律失常的作用。

人參皂苷Re；膜片鉗；鈉通道電流；鉀通道電流

人參皂苷Re（Ginsenoside Re）是人參根中的主要人參皂苷類物質(zhì)，屬三醇類人參皂苷。大量研究證明人參皂苷對離體心肌細(xì)胞和多種動(dòng)物心肌缺血、心肌梗死、再灌注損傷均具有保護(hù)作用［1］，從人參化學(xué)成分與抗心律失常構(gòu)效關(guān)系來看，人參皂苷Re抗心律失常活性最強(qiáng)［2］。最近研究表明人參皂苷Re能夠通過抑制心肌細(xì)胞L-型鈣電流和增強(qiáng)延遲整流鉀電流縮短動(dòng)作電位發(fā)揮抗心律失常的作用［3］，但是人參皂苷Re對鈉電流及其他類型鉀電流的作用還不清楚。我們在通過膜片鉗技術(shù)觀察了人參皂苷Re對大鼠心室肌細(xì)胞電壓依賴性鈉通道、瞬時(shí)外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道電流的影響。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑

1.1.1 藥物 人參皂苷Re由中國藥品生物制品檢定所購置；配液所需藥品除指定外皆由英國Alfa Aesar公司購置。

1.1.2 試劑（mmol／L） 無鈣臺(tái)式液：NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO40.33，MgCl21，Glucose 10，Hepes 10（pH7.4 NaOH）；KB液：KOH 70，KCl 40，KH2PO420，Glutamic acid 50，MgCl23，Taurine 20，EGTA 0.5，Hepes 10，Glucose 10（pH7.4 KOH）；記錄鈉電流細(xì)胞外液：Choline chloride 130，NaCl 10，MgCl21，NaH2PO40.33，CsCl 5.4，CaCl20.1，CoCl20.1，Glucose 10，HEPES 10（pH 7.4 CsOH）；記錄鈉電流電極內(nèi)液：NaCl 5，MgATP 5，CsCl 20，CsF110，MgCl21 EGTA 5，HEPES 5（pH 7.2 CsOH）；記錄鉀電流細(xì)胞外液：Choline chloride 135，KCl 5.4，MgCl21.1，CaCl21.8，CdCl20.5，Glucose 10，HEPES 10（pH 7.4 KOH）；記錄鉀電流電極內(nèi)液：KCl 140，Na2ATP 5，MgCl21，EGTA 5，HEPES 10，Glucose 10，（pH 7.2 KOH）

1.2 心室肌細(xì)胞的分離［4］取SD大鼠（180±10）g，♂，10%烏拉坦腹腔麻醉，迅速開胸取出心臟，在零度無鈣臺(tái)式液中剝離出主動(dòng)脈，懸掛于Langendorff心臟灌流裝置上，確保管口不超過主動(dòng)脈的心臟入口，棉線固定，行主動(dòng)脈逆行灌流，流量為7～8 mL／min。先用無鈣臺(tái)氏液灌流5 min，接著用含酶鈣臺(tái)氏液（0.4 mg／mL膠原酶Ⅱ（worthington）+0.03 mg／mL蛋白酶ⅩⅣ（sigma）+0.9 mg／mL牛血清白蛋白（sigma）+ CaCl20.05mmol／L）灌流19～24 min，最后用低鈣臺(tái)式液（CaCl20.4mmol／L）灌流5 min，剪取心室組織在KB液中剪碎，吹打，用100目篩網(wǎng)過濾，最后將細(xì)胞保存在KB液中，4℃低溫狀態(tài)下，細(xì)胞可存活36h。整個(gè)過程灌流液維持溫度在（37±1）℃，灌流液中充純氧氣。

1.3 離子通道電流的記錄 通過電極拉制儀（PULL -100，美國）拉制電極，使玻璃電極充電極內(nèi)液后阻抗達(dá)到2～4MΩ。吸取幾滴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池中，細(xì)胞貼壁后選擇桿狀、表面光滑、紋理清晰的心肌細(xì)胞，利用三維操縱器移動(dòng)電極貼近目標(biāo)細(xì)胞，并輕壓在細(xì)胞表面，稍加負(fù)壓即可形成1GΩ水平以上的高阻抗封接，再用較大負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞記錄形式。實(shí)驗(yàn)過程由刺激采集軟件Pulse控制，經(jīng)膜片鉗放大器（EPC10，德國），通過模數(shù)轉(zhuǎn)換采集數(shù)據(jù)，存放于計(jì)算機(jī)硬盤。

記錄鈉電流：采用氯化膽堿替代細(xì)胞外大部分Na+，采用Co2+抑制電壓依賴性鈣通道，Cs+替換K+。給予細(xì)胞鉗制在-110 mV，給予-30mV，25ms的除極電壓，可以得到迅速活化，迅速緩慢失活的內(nèi)向電流，這種電流能夠被河豚毒素（TTX）0.001mmol·L-1阻斷。細(xì)胞鉗制在-120 mV，給予細(xì)胞一系列從-90 mV～40 mV，以10 mV步增，脈寬25 ms的測試電壓，可以記錄到隨不同刺激電壓產(chǎn)生的電流軌跡，測量各個(gè)電流軌跡的峰值電流制作給藥前后電流電壓曲線。記錄瞬時(shí)外向鉀通道電流：采用采用氯化膽堿替代細(xì)胞外Na+，采用Cd2+抑制電壓依賴性鈣通道。細(xì)胞鉗制在-70mV，給予細(xì)胞一系列從-40 mV～50 mV，以10 mV步增，脈寬250 ms的測試電壓，可以得到一組迅速活化，迅速失活的外內(nèi)向電流，這種電流能夠被4 -AP（0.5mmol·L-1）阻斷。記錄內(nèi)向整流鉀通道電流：將細(xì)胞鉗制在-40mV，給予細(xì)胞一系列從-120mV～30 mV，以10mV步增，脈寬500ms的測試電壓，可以得到一組幾乎不失活的穩(wěn)態(tài)電流，在超極化時(shí)為很大的內(nèi)向電流，去極化時(shí)變?yōu)檩^小的外向電流，這種電流可被TEA阻斷。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Re對鈉通道電流的影響 給予人參皂苷Re（10，100μmol·L-1）后，單一去極化電壓刺激后，鈉通道電流幅度呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢（圖1A），對通道電流幅度的抑制率分別為（25.5±5.7）%（n＝3）；（46.2±18）%（n＝4）。給予不同的刺激電壓后，各電流峰值呈減小趨勢（圖1B）制作電流電壓曲線后發(fā)現(xiàn)給藥后電流電壓曲線上移，峰值電壓無明顯改變（圖1C）。

圖1 人參皂苷Re對鈉電流的抑制作用：A.人參皂苷Re（10.100μmol·L-1）對電流峰值的作用，洗脫后回復(fù)明顯。B.人參皂苷Re對一組刺激電壓誘導(dǎo)出的鈉電流軌跡影響。c.取電流峰值制作電流電壓曲線。

2.2 人參皂苷Re對瞬時(shí)外向鉀通道電流（Ito）和內(nèi)向整流鉀通道電流（Ik1）的影響 在記錄兩種鉀電流時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在受到組合電壓刺激后通道電流會(huì)出現(xiàn)隨時(shí)間經(jīng)過的自發(fā)衰減，對評價(jià)藥物作用發(fā)生影響，因此在觀察藥物的作用時(shí)，采用雙刺激電壓。給予人參皂苷Re（10，100μmol·L-1）對后Ito幅度略有抑制（圖2A），，物洗脫后電流恢復(fù)，其中100μmol·L-1人參皂苷對電流的抑制率為（13±9）%（n＝3）。給予人參皂苷Re（10，100μmol·L-1）后Ik1幅度呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢，藥物洗脫后電流完全恢復(fù)（圖2B）。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)（10，100μmol·L-1）人參皂苷Re對通道電流幅度的抑制率分別為（16.3±8.7）%（n＝5）和（35.4± 11.2）%（n＝5）。

圖2 人參皂苷Re對鉀電流的抑制作用：A.人參皂苷Re（10，100μmol·L-1）對雙刺激電壓誘導(dǎo)出的Ito軌跡影響；B.人參皂苷Re（10，100μmol·L-1）對雙刺激電壓誘導(dǎo)出的Ik1軌跡影響。

3 討論

鈉通道一般是I類抗心律失常藥物的靶點(diǎn)。近些年心肌細(xì)胞的電生理研究表明：缺血后細(xì)胞內(nèi)的無氧代謝導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值的降低及由此引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Na+超載，過多的Na+進(jìn)入導(dǎo)致Na+-Ca2+交換作用的反轉(zhuǎn)，即細(xì)胞外的Ca2+流入細(xì)胞內(nèi)，排出細(xì)胞內(nèi)過多的Na+，細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+增加，此時(shí)，由于缺氧使心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器攝取Ca2+能力下降，從而導(dǎo)致了Ca2+超載的發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載會(huì)引起磷脂酶、蛋白水解酶等的激活，導(dǎo)致肌原纖維攣縮斷裂，生物膜機(jī)械損傷，細(xì)胞骨架破壞，心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷［5-6］。因此，通過抑制鈉通道來抑制Na+超載，從而阻斷Ca2+超載的發(fā)生對心肌細(xì)胞的缺氧保護(hù)作用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Re能夠濃度依賴性的抑制心肌細(xì)胞鈉電流，表明人參皂苷Re抗心律失常的作用，可能與此有關(guān)。

傳統(tǒng)Ⅲ類抗心律失常藥通過阻滯心肌的鉀通道發(fā)揮作用，心肌細(xì)胞膜上的鉀通道亞型多，性質(zhì)復(fù)雜。Ik1主要作用在于維持心肌細(xì)胞的靜息膜電位，在膜超極化狀態(tài)下，鉀離子具有內(nèi)流趨勢，使膜恢復(fù)靜息期電位；在去極化狀態(tài)下，鉀離子具有外流趨勢，恢復(fù)膜原有的極化狀態(tài)［7］。人參皂苷Re抑制Ik1的內(nèi)向成分，可能在靜息期使膜電位向超極化方向變化，膜興奮性降低，對于閾下刺激或“額外”刺激反應(yīng)性降低，發(fā)揮其抗心律失常的作用。

心肌細(xì)胞的鈉通道密度大且通道電流動(dòng)力過程相當(dāng)快，所以由串聯(lián)電阻的電壓引起鉗制水平的漂移和對膜電容充放電速度的影響對所測INa干擾非常嚴(yán)重，因此對串聯(lián)電阻和膜電容補(bǔ)償要求很高。為減少上述干擾，本實(shí)驗(yàn)在測定INa時(shí)，用氯化膽堿代替部分氯化鈉，使細(xì)胞內(nèi)外鈉離子濃度差降至30mmol／L，并在室溫下（20～22℃），而不采取通常的37℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這樣可明顯減少INa幅度，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

我們的研究首次發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re能夠抑制心肌細(xì)胞鈉電流和內(nèi)向整流的鉀電流，這個(gè)結(jié)果表明人參皂苷Re不僅通過抑制L-型鈣電流和增強(qiáng)延遲整流鉀電流，而且通過抑制鈉電流和內(nèi)向整流的鉀電流發(fā)揮抗心律失常的作用。

［1］趙立波，佟力，趙洪序，等.人參總皂甙對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華胸心血管外科雜志，1994，10（4）：353-354.

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（2013-09-12收稿）

Effects of Ginsenoside Re on Sodium and Potassium Current in Rat Ventricular Myocytes

Meng Hongxu Yao Mingjiang，Liu Jianxun
（Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing key Laboratory of pharmacology of Chinesemateriamedica，Beijing 100091，China）

Objective：To investigate the effectsof Ginsenoside Re on voltage-dependent sodium current and potassium current in rat ventricularmyocytes，and to investigate themechanism of antiarrhythmia.Methods：The effectofGinsenoside Re on sodium current（INa），transient outward potassium current（Ito）and inwardly rectifie-d potassium current（Ik1）were assessed by applying whole-cell patch clamp technique in single cardiac myocytes.Results：Ginsenoside Re（10，100μmol·L-1））was shown to inhibit the altitude of INaand the inhibition ratio was25.5±5.7%（n＝3）and 46.2±18%（n＝4）.Itwas shown a little inhibition by Ginsenoside Re（100μmol ·L-1））and its effectswere reversible completely afterwashout.The inhibition ratio of Ito was 13±9%（n＝3）in 100μmol·L-1）. Ginsenoside Re（10，100μmol·L-1））inhibited the altitude of Ik1and the inhibition ratiowas16.3±8.7%（n＝5）and 35.4±11.2%（n＝5）.Conclusion：Ginsenoside Re can inhibit sodium current and potassium currents to produce antiarrhythmic effect.

Ginsenoside Re；Pathch clamp technique；Sodium current；Potassium current

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.10.005

中國中醫(yī)科學(xué)院自助選題項(xiàng)目（編號(hào)：zz070821），科技部十二五重大新藥創(chuàng)制課題（編號(hào)：2012ZX09301002-004）

孟紅旭，男，博士，助理研究員，研究方向中藥藥理學(xué)，E-mail：am fd003＠163.com

劉建勛，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事心腦血管藥理學(xué)研究，Tel：010-62835601，E-mail：liujx0324＠sina.com