姚明江 劉建勛 張 鵬 楊 斌 徐 立 王光蕊

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京，100091）

中藥藥效評價專題

清熱解毒中藥有效組分配伍對內(nèi)毒素致大鼠感染性腦水腫的保護作用

姚明江 劉建勛 張 鵬 楊 斌 徐 立 王光蕊

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京，100091）

目的：探討清熱解毒中藥黃芩、梔子等有效組分配伍而成的注射液（TLQN注射液）對內(nèi)毒素（LPS）所致大鼠感染性腦水腫的腦保護作用及其可能機制。方法：70只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、清開靈組（3 mL／kg）、地塞米松組（10 mg／kg）、TLQN注射液低、中、高劑量組（24、47.5、95mg／kg）。經(jīng)頸內(nèi)動脈注射LPS（1 mg／kg）建立感染性腦損傷模型，各給藥組在注入LPS后立即尾靜脈注射相應(yīng)藥物。造模前以及造模6h后各測量一次體溫。取各組腦組織標本，干濕法測定腦組織含水量，甲酰胺法檢測腦組織伊文思藍（EB）水平，HE染色后觀察各組腦組織病理形態(tài)變化，酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測各組血清TNF-α、IL-6含量。結(jié)果：模型組體溫、腦組織含水量和EB含量明顯高于正常組（P＜0.01），皮質(zhì)及海馬區(qū)存在廣泛的神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞損傷，血清TNF-α及IL-6水平顯著升高（P＜0.01）；TLQN注射液可明顯降低模型大鼠體溫（P＜0.05），減少腦組織含水量及EB含量（P＜0.05，0.01），改善腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞損傷，顯著降低血清TNF-α和IL-6水平（P＜0.05）。結(jié)論：清熱解毒中藥有效組分配伍對LPS致大鼠感染性腦損傷有保護作用，其機制可能與抑制TNF-α和IL-6等細胞因子過度產(chǎn)生有關(guān)。

清熱解毒；組分配伍；脂多糖；感染性腦水腫；炎癥

感染性腦水腫是由感染引起的，以血管源性腦水腫為主，同時有細胞毒性腦水腫存在的急性彌漫性混合性腦水腫，可導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高、腦疝等并發(fā)癥，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病重要死亡原因之一。目前治療感染性腦水腫的手段有限，相關(guān)研究不多，制約了治療感染性腦水腫深層次研究的開展。本研究利用內(nèi)毒素脂多糖（LPS）建立大鼠感染性腦水腫模型，采用具有清熱解毒功效中藥有效組分配伍的注射液進行治療，并觀察其對感染性腦水腫大鼠模型體溫、腦組織含水量、EB含量、腦組織病理形態(tài)學(xué)及血清TNF-α、IL-6的影響，探討清熱解毒中藥有效組分配伍注射液（TLQN注射液）對感染性腦水腫的治療作用，旨在為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠，體重190～210g，由維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXX（京）2007-0001。隨機分為7組：正常組、模型組、清開靈組（給藥劑量3 mL／kg）、地塞米松組（給藥劑量10 mg／kg）、清熱解毒中藥有效組分配伍注射液（TLQN）低、中、高劑量組（24、47.5、95 mg／kg）。

1.2 藥品與試劑 清熱解毒中藥有效組分配伍注射液（TLQN注射液，其中黃芩苷、梔子苷含量分別為1.7、20 mg／mL）由西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥學(xué)室制備，原注射液設(shè)為高劑量組藥物，實驗前在超凈臺中以0.9%生理鹽水將藥物依次倍比稀釋，得中、低劑量組藥物。水合氯醛（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司），生理鹽水（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司），脂多糖（LPS大腸桿菌O55：B5，sigma公司），伊文思藍（EB），清開靈注射液，磷酸地塞米松注射液。大鼠血清TNF-α、IL-6試劑盒由加拿大GBD公司生產(chǎn)（批號：T041-40，I046-10）。

1.3 動物模型制作方法 參照田培超［1］等造模方法，將實驗動物以4%水合氯醛（1 mL／100g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后取仰臥位固定，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈。結(jié)扎并電凝斷右側(cè)頸外動脈，殘端保留5～8 mm，動脈夾暫時夾閉右頸總動脈近心端，從右側(cè)頸外動脈殘端向頸內(nèi)動脈注入LPS（1 mg／kg），注射完成后，結(jié)扎穿刺部位，并松開頸總動脈處動脈夾，恢復(fù)本側(cè)血供。各給藥組在注入LPS后立即尾靜脈注射相應(yīng)藥物。

1.4 體溫測定及取材 各組于造模前及造模6h后各測量一次體溫，作致熱前后體溫差（ΔT）值的比較。注射LPS 6h后，再次麻醉大鼠，經(jīng)心臟取血3 mL，隨后經(jīng)股靜脈注射20g／L的伊文思藍（EB，2 mL／kg），5 min后斷頭處死，立即開顱取腦，并將腦由正中線切開，右側(cè)半腦沿冠狀面分為3部分，分別留作EB含量測定、含水量測定及病理染色。全血靜置2 h后離心（2500 r／min，4℃，20 min），取上清，-20℃冰箱保存。

1.5 腦組織含水量的測定 干濕法測定腦組織含水量，按以下公式計算：腦組織含水量（%）＝（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）／濕質(zhì)量×100%。

1.6 血腦屏障通透性的測定 甲酰胺法測定腦組織中伊文思蘭的含量，判斷血腦屏障的破壞程度。

1.7 腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察 所取腦組織塊投入10%中性福爾馬林固定液，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色后進行皮層及海馬病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.8 血清TNF-α、IL-6含量的測定 每組隨機選取8只動物血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定TNF-α、IL-6含量。試劑盒由加拿大GBD公司生產(chǎn)，按照試劑盒要求嚴格操作。

2 結(jié)果

2.1 清熱解毒中藥有效組分配伍注射液對模型大鼠致熱前后溫差的影響 造模6 h后，與正常組相比，模型組大鼠體溫明顯升高（P＜0.01）。給藥后，與模型組相比，TLQN高劑量組溫差與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表1

表1 對模型大鼠體溫的影響（±s）

表1 對模型大鼠體溫的影響（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

分組劑量（mg／kg）動物數(shù)（n）溫差（△T℃）10 0.16±0.24模型組10 1.13±0.41**清開靈組3 mL 9 0.84±0.30地塞米松組10 10 0.61±0.40*TLQN低劑量組24 10 1.01±0.35 TLQN中劑量組47.5 10 0.97±0.25 TLQN高劑量組95 10 0.69±0.34正常組*

2.2 清熱解毒中藥有效組分配伍注射液對模型大鼠腦組織含水量、EB含量的影響 造模6 h后，與正常組相比，模型組大鼠腦含水量、腦內(nèi)EB含量明顯升高（P＜0.01）。給藥后，與模型組相比，TLQN低、中、高劑量組腦含水量明顯減少（P＜0.05～0.01），TLQN中、高劑量組腦內(nèi)EB含量明顯減少（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

2.3 清熱解毒中藥有效組分配伍注射液對模型大鼠腦組織病理形態(tài)的影響 大鼠腦組織切片HE染色后，于光鏡下觀察。正常組皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)均未見明顯異常，間質(zhì)未見炎性細胞浸潤、充血、出血等；模型組皮質(zhì)區(qū)可見小膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)元細胞變性、水腫、壞死，海馬區(qū)神經(jīng)元細胞變性、水腫、壞死，細胞排列紊亂，間質(zhì)血管擴張，水腫；清開靈組、地塞米松組及TLQN各劑量組腦組織病變均較模型組減輕，僅見少量的間質(zhì)血管擴張，偶有小膠質(zhì)細胞增生，神經(jīng)元變性。見圖1，圖2。

表2 對模型大鼠腦組織含水量、EB含量的影響（±s）

表2 對模型大鼠腦組織含水量、EB含量的影響（±s）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組劑量（mg／kg）動物數(shù)（n）腦組織含水量（%）EB含量（μg／g ）1077.73±0.8012.55±1.60模型組1079.21±0.56△△16.42±2.48△△清開靈組3mL1078.71±1.2212.17±3.26**地塞米松組10978.48±0.89*14.03±2.58 TLQN低劑量組241078.17±0.82**14.14±2.28 TLQN中劑量組47.51078.31±0.97*14.20±1.45*TLQN高劑量組951078.01±0.54**13.55±2.48正常組*

2.4 清熱解毒中藥有效組分配伍注射液對模型大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6水平的影響 造模6h后，與正常組相比，模型組大鼠血清TNF-α及IL-6水平顯著升高（P＜0.01）。給藥后，與模型組相比，TLQN高劑量組可顯著降低血清TNF-α水平（P＜0.05），中劑量組可顯著降低血清IL-6水平（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 對模型大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響（±s，n＝8）

表3 對模型大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影響（±s，n＝8）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組劑量（mg／kg）TNF-α（pg／mL）IL-6（pg／mL）20.85±4.31583.75±92.33模型組31.35±9.78△△758.25±67.27△△清開靈組3mL26.79±4.92671.30±122.76地塞米松組1022.69±6.41*616.42±56.39**TLQN低劑量組2427.79±4.49686.02±123.84 TLQN中劑量組47.529.00±12.63647.11±103.85*TLQN高劑量組9521.21±7.04*正常組700.39±102.24

3 討論

腦水腫分為血管源性和細胞毒性腦水腫兩大類，血管源性腦水腫主要是血腦屏障（bloodbrainbarrier，BBB）受損，血漿成份滲出到細胞外間隙；細胞毒性腦水腫主要特點是細胞膜上的離子泵受損，造成細胞內(nèi)水鈉潴留。感染性腦水腫（感腦）是各種病原體感染導(dǎo)致的腦水腫，其特點是急性、彌漫性兼有血管源性和細胞毒性腦水腫特點的混合性腦水腫［2］。本研究采用LPS誘導(dǎo)大鼠感染性腦水腫模型是最常用、最有效的感染性腦水腫的動物模型［1］。

圖1 對模型大鼠皮質(zhì)區(qū)病理形態(tài)的影響（HE染色，400×）

圖2 對模型大鼠海馬區(qū)病理形態(tài)的影響（HE染色，400×）

實驗結(jié)果顯示，模型組腦組織含水量和EB含量明顯高于正常組，病理形態(tài)也顯示皮質(zhì)及海馬區(qū)廣泛的神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞損傷，說明已成功建立以血腦屏障通透性增高，腦組織含水量增多為特征的感染性腦水腫模型，并伴有體溫明顯升高的全身性感染的表現(xiàn)。實驗結(jié)果還顯示，模型組大鼠血清TNF-α及IL-6水平較正常組顯著升高，說明TNF-α和IL-6參與了LPS誘導(dǎo)的腦水腫發(fā)生、發(fā)展過程，介導(dǎo)了腦組織的損傷和破壞，并引起相應(yīng)的病理改變和臨床表現(xiàn)。

TNF-α和IL-6是兩種主要的促炎癥細胞因子，在腦水腫后的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。TNF-α是使血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達上調(diào)的重要細胞因子，可以引起白細胞的黏附、聚集、移行，血腦屏障破壞，興奮性氨基酸受體活化，或刺激膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量NO而造成神經(jīng)毒性作用和腦水腫［3］。IL-6主要由膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，是一種多效性促炎癥細胞因子，能調(diào)節(jié)多種細胞功能，包括細胞增殖、細胞分化、免疫防御機制及血細胞生成等。適當(dāng)濃度的IL-6是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能不可缺少的介質(zhì)，而當(dāng)IL-6其大量產(chǎn)生時，主要表現(xiàn)為負向免疫調(diào)節(jié)［4］。

本研究采用的清熱解毒中藥有效組分配伍注射液（TLQN注射液）是由清熱解毒中藥黃芩、梔子等有效組分按特定比例配伍而成的復(fù)方注射液。黃芩的主要有效成分黃芩苷（Baicailin，BC）具有較強的抗炎、降脂、解熱、鎮(zhèn)靜作用。研究表明黃芩苷對感染性腦水腫有保護作用［5］，其機制可能與抑制NF-кB異?；罨虸кBa降解有關(guān)［6］。還有研究表明［7］，黃芩苷能抑制NO的分泌，從而減輕細菌脂多糖對星形膠質(zhì)細胞損傷。此外，黃芩苷聯(lián)合抗生素治療能降低細菌性腦膜炎腦組織白細胞數(shù)、蛋白質(zhì)及乳酸含量，并且可減少腦組織的含水量，明顯減輕單純抗生素治療早期腦損傷的一過性加重，其機制可能是通過減少腦內(nèi)IL-1和TNF-α的產(chǎn)生，從而發(fā)揮保護腦組織和減輕繼發(fā)性腦損傷的作用［8］。梔子的主要有效成分梔子苷（Geniposide）有抗炎、解熱、利膽等多種藥理作用。研究表明，梔子苷具有明顯的抗炎活性，對二甲苯、巴豆油引起的小鼠耳腫脹具有顯著效果，且其作用方式不同于腎上腺皮質(zhì)激素類藥物，其抗炎活性的原因，可能與其抑制堿性磷酸酶的活性有關(guān)［9］。本實驗結(jié)果顯示，TLQN注射液可顯著降低模型組動物血清中TNF-α和IL-6水平，同時明顯降低模型動物的體溫，減少腦組織含水量及EB含量，改善腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞損傷。提示該注射液對LPS致大鼠感染性腦損傷有保護作用，其機制可能與抑制TNF-α和IL-6等細胞因子過度產(chǎn)生有關(guān)。

［1］田培超，喬曉輝，羅強，等.丙酮酸乙酯對內(nèi)毒素致幼鼠感染性腦損傷的保護作用［J］.實用兒科臨床雜志，2008，23（16）：1270-71.

［2］Yu PL，Zhou PF，Yang YJ，et al.Brain edemamodel induced with typhoid endotxin in rabbits.In：Inaba I，et al（eds）：Brain edema［M］.Berlin. Springer-Verlag，1985：113-116.

［3］王懷立，高東培，蘆軍萍，等.TNF-α、IL-8在脂多糖致大鼠腦水腫中的表達［J］.免疫學(xué)雜志，2008，18（6）：440-446.

［4］龐國象，湯斌，王優(yōu)，等.急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒腦脊液中IL-6和TNF水平的測定及臨床意義［J］.中華實用中西醫(yī)雜志，2001，14（1）：51-54.

［5］楊于嘉，朱彩云，陳翔，等.黃芩甙對百日咳菌液致大鼠腦水腫的保護作用［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，1998，78（8）：630-632.

［6］俞燕，楊于嘉.毛定安黃芩甙對大鼠感染性腦水腫NF-кB活性的影響［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2000，2（6）：386-389.

［7］劉杰波.黃芩苷對細菌脂多糖致星形膠質(zhì)細胞損傷保護機制的研究［J］，湖南中藥導(dǎo)報，2004，10（3）：79-83.

［8］唐勇軍，李新中，鄢慧明.黃芩苷對兔大腸桿菌腦膜炎的輔助治療作用及機制探討［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2009，31（9）：1102-1104.

［9］任治軍，張立明，何開澤.梔子主要成分的提取工藝及藥理研究進展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（6）：831-836.

（2013-09-12收稿）

Protective Effect of Heat-Clearing An titoxicant Herb Com ponents Com patibility on Infectious Brain Edema in Rats induced by Lipopolysaccharide

Yao Mingjiang，Liu Jianxun，Zhang Peng，Yang Bin，Xu Li，Wang Guangrui
（Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing key Laboratory of pharmacology of Chinesemateria medica，Beijing 100091，China）

Objective：To explore the protective effectof Heat-Clearing antitoxicant herb（Scutellaria baicalensis Georgi，Gardenia jasminoides Ellis，et al）component compatibility（TLQN Injection）on infectious brain edema in rats induced by lipopolysaccharide（LPS）and its possible therapeuticmechanism.Methods：A total of70 SD ratswere divided random ly intomodel group，control group，Qingkailing group（3mL／kg），Dexamethasone group（10mg／kg），TLQN low-dose（24mg／kg），middle-dose（47.5 mg／kg）and highdose（95 mg／kg）group.Models ofacute infectious brain edema of ratswere prepared by injecting LPS（1mg／kg）via left internal carotid artery，and the drugswas injected at the same time as LPSwas given via tail vein.6h after themodels were established，the body temperature，the water content and EB content in the brain wasmeasured，the pathological changeswas observed and the serum TNF-α、IL-6 wasmesured by ELISA.Results：The body temperature，thewater contentand EB content in the brain were higher inmodel group than in control group，as well as injured cortical and hippocampacal neurons and glial cells，the serum TNF-αand IL-6 levels inmodel group were higher than control group；TLQN injection can significantly decrease the body temperature，reduce water content and EB content，improve injured neurons and glial cells，and decrease the serum TNF-αand IL-6 levels.Conclusion：The Heat-Clearing antitoxicant herb component compatibility injection may lighten the degree of infectious brain injury induced by LPS，the possiblemechanism could be it can inhibit the overproduction of cytokines such as TNF-αand IL-6.

Heat-Clearing antitoxicant；Component compatibility；Lipopolysaccharide；Infectious brain edema；Inflammatory response

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.10.001

國家自然科學(xué)基金項目（編號：30772755）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（編號：2009ZX09103-317）；科技部十二五重大新藥創(chuàng)制課題（編號：2012ZX09301002-004）

姚明江，男，博士，助理研究員，研究方向：腦血管與神經(jīng)系統(tǒng)疾病中藥藥理學(xué)，E-mail：ym j_ren＠163.com

劉建勛，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事心腦血管藥理學(xué)研究，Tel：010-62835601，E-mail：liujx0324＠sina.com