李晉玉徐 林金 合譚榮偉俞 興

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨科中心，北京，100700；2北京市延慶中醫(yī)院骨科，北京，102100；3清華大學(xué)材料學(xué)院，北京，100086；4深圳蘭度生物材料有限公司，深圳，518057）

中藥提取物AFDR對IBRC材料復(fù)合ADMSCs應(yīng)用于兔腰椎橫突間融合的影響

李晉玉1徐 林1金 合2譚榮偉3，4俞 興1

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨科中心，北京，100700；2北京市延慶中醫(yī)院骨科，北京，102100；3清華大學(xué)材料學(xué)院，北京，100086；4深圳蘭度生物材料有限公司，深圳，518057）

目的：本實(shí)驗(yàn)采用可注射骨修復(fù)材料（Injectable Bone Regeneration Composite，IBRC）復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal cells，ADMSCs）應(yīng)用于兔腰椎橫突間融合模型，骨碎補(bǔ)總黃酮（Assemble Flavone of Drynaria Rhizome，AFDR）灌胃，觀察融合效果。方法：60只成年白兔，制成兔腰椎橫突間融合模型，采用安全隨機(jī)法隨機(jī)分為5組：A組植入IBRC材料結(jié)合AFDR灌胃；B組植入IBRC材料復(fù)合自體髂骨（Autologous iliac Crest Bone，ACB），結(jié)合去離子水（Deionized Water，DW）灌胃；C組植入IBRC材料+ADMSCs，DW灌胃；D組，植入ACB，DW灌胃；E組植入ACB，AFDR灌胃。以術(shù)后第8周為觀察時間點(diǎn)，進(jìn)行大體觀測，手觸檢測，X線片，組織學(xué)觀察。結(jié)果：IRBC+ADMSCs，ACB+AFDR組獲得較好的融合率，顯著高于單純IRBC，ACB組（P＜0.05），與ACB+DW組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：自體ADMSCs結(jié)合IRBC材料可實(shí)現(xiàn)與ACB組相似的融合率，結(jié)合中藥AFDR灌胃，能夠提高兔腰椎橫突間的骨性融合率。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；兔；腰椎橫突間融合；可注射骨修復(fù)材料；骨碎補(bǔ)總黃酮

自體髂骨移植一直被認(rèn)為是脊柱融合領(lǐng)域的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但來源有限，創(chuàng)傷大，并伴有取骨區(qū)疼痛、神經(jīng)損傷、骨折、感染等并發(fā)癥。因此，急需制備理想的人工骨移植修復(fù)材料及多樣治療手段來促進(jìn)脊柱融合［1-3］。本實(shí)驗(yàn)采用可注射骨修復(fù)材料（Injectable Bone Regeneration Composite，IBRC）復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal cells，ADMSCs）應(yīng)用于兔腰椎橫突間融合模型，骨碎補(bǔ)總黃酮（Assemble Flavone of Drynaria Rhizome，AFDR）

灌胃，觀察融合效果，探討其在脊柱融合中的應(yīng)用價值，為探索一種可應(yīng)用于促進(jìn)脊柱融合，滿足臨床需求的的骨修復(fù)材料奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為脊柱融合自體骨替代材料提供新的方向，實(shí)現(xiàn)以中西醫(yī)結(jié)合的治療手段提高腰椎橫突間植骨融合率的創(chuàng)新探索?，F(xiàn)將成果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 60只新西蘭白兔，體質(zhì)量（2.5± 0.3）kg，雌雄不限，SFP級，實(shí)驗(yàn)動物由北京西山實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖廠提供，IBRC材料（清華大學(xué)材料系饋贈），骨碎補(bǔ)總黃酮（每1 g提取物含生藥66.67 g）（北京岐黃藥業(yè)饋贈）。制成兔腰椎橫突間融合模型，采用安全隨機(jī)法隨機(jī)分為5組，每組12只：A組植入IBRC材料結(jié)合AFDR灌胃；B組植入IBRC材料復(fù)合自體髂骨（Autologous iliac Crest Bone，ACB），結(jié)合去離子水（Deionized Water，DW）灌胃；C組植入IBRC材料+ ADMSCs，DW灌胃；D組，植入ACB，DW灌胃；E組植入ACB，AFDR灌胃。

1.2 給藥方法 術(shù)后第2 d，A、B、C、D、E各組開始灌胃，AFDR根據(jù)人兔換算公式給藥，日1次，給藥8周。DW灌胃劑量同AFDR灌胃劑量。

1.3 取材時間點(diǎn)及數(shù)量 A、B、C、D、E組分別在術(shù)后第8周各處死12只實(shí)驗(yàn)動物取材。

1.4 橫突間融合方法 60只實(shí)驗(yàn)白兔麻醉成功后取俯臥位（3%戊巴比妥鈉30 mg／kg耳緣靜脈麻醉），腰骶部備皮，消毒，常規(guī)無菌鋪巾，沿關(guān)節(jié)突外側(cè)以L5棘突為中心做長約4 cm縱形手術(shù)切口，逐層切開皮膚皮下，剝離肌肉，顯露L5-L6橫突，牙科電轉(zhuǎn)打磨去皮質(zhì)，顯露橫突髓腔，分別植入IBRC材料、復(fù)合ADMSCS的IBRC材料以及ACB（ACB組沿髂沿做切口，兩側(cè)各取18 mm×5 mm×3 mm髂骨塊，以咬骨鉗修剪成14 mm×1.5mm×1.5mm單面皮質(zhì)骨條植入同側(cè)L5-L6橫突間）。術(shù)后籠養(yǎng)，肌注青霉素80萬U／d，連續(xù)5 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 X線片觀察 拍攝兔后前位X線片，按照Curylo的分級標(biāo)準(zhǔn)評分，3、4分診斷為堅強(qiáng)融合；2分及以下診斷為不融合。有2名有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師用雙盲法評估融合情況［4］。

1.5.2 大體觀察 處死后剔除肌肉后觀察腰5～6橫突間植骨融合情況。

1.5.3 手觸檢測 檢查植入材料硬度，輕柔檢測腰5～6活動度，無活動判定為融合，有活動判定為不融合。

1.5.4 組織學(xué) 需行組織學(xué)觀察的標(biāo)本，在手觸檢測、X線攝片后立即用10%中性福爾馬林固定24 h，然后脫水、包埋、切片。切片行H.E染色、Masson染色和電鏡觀察。

1.6 數(shù)據(jù)處理運(yùn)用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，以（±s），采用單因素和多因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 并發(fā)癥 A組：1只術(shù)后出現(xiàn)下肢癱瘓，1只雙下肢癱瘓，術(shù)后，8 d、10 d死亡，補(bǔ)作2只。B組：1只左下肢癱瘓，術(shù)后72 h后恢復(fù)。兔腰骶神經(jīng)走行于髂骨近端下方，注意保護(hù)后再未出現(xiàn)下肢癱瘓。感染3例，均在取材時發(fā)現(xiàn)，2例為淺部輕度感染，不影響對融合的觀察。C組：2只右下肢癱瘓生存至取材。D組：2只術(shù)后均第2 d死亡，分析為創(chuàng)傷大、出血多引起，立即補(bǔ)作2只。其他實(shí)驗(yàn)動物均耐受麻醉、手術(shù)，術(shù)后當(dāng)天正常喂食，不限制活動，1周后恢復(fù)體重。

2.2 大體觀察 術(shù)后8周后處死，取材進(jìn)行大體觀察。A組無明顯融合骨塊形成，IBRC材料零散，有軟組織包裹，沒有與植骨床融為一體，觸之脫落。B組自體髂骨與IBRC材料部分區(qū)域有緊密結(jié)合，未見表面有骨質(zhì)長成。C組IBRC材料與植骨床整合較好，纖維連接和骨性連接同時存在，各組均未出現(xiàn)明顯的炎性反應(yīng)。D、E組在植骨床處有完整骨塊形成，與自體骨整合為一體，靠近植骨床的部位，移植骨和自體骨整合牢固，觸之堅硬不脫落。

2.3 X線片觀察 A組：標(biāo)本未見骨痂生長，僅見橫突部有少許骨痂；B組：6例有較少骨痂生長，2例有較多骨痂生長，但不連續(xù)；余有連續(xù)骨痂；C組、E組：2例有較多骨痂生長，但不連續(xù)；余有連續(xù)骨痂；D組：4例有較多骨痂生長，但不連續(xù)；余有連續(xù)骨痂。按照Curylo制定客觀分級標(biāo)準(zhǔn)，評分見表1。

表1 Curylo射線數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

2.4 手觸檢測 A組沒有實(shí)現(xiàn)任何的骨性融合；C、E組大部分獲得堅固融合；C、D、E組未融合比率明顯低于A、B組（P＜0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義；ACB，C、C、E組之間在堅固融合率上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。D組雖堅固融合率低于C組和E組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 手工檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

2.5 組織學(xué)觀察A組結(jié)果 IBRC材料無明顯降解，纖維結(jié)締組織長入，無小梁骨長入，無炎性反應(yīng)。B組結(jié)果：在自體髂骨和IBRC材料結(jié)合處可見少許軟骨長成，無明顯小梁骨長入，材料周圍長入纖維結(jié)締組織，IBRC材料明顯降解。C組結(jié)果：小梁骨顯著長成，在小梁骨周邊大量纖維結(jié)締組織長入，在小梁骨的周邊，有明顯的軟骨細(xì)胞聚集，IBRC材料明顯降解。D組結(jié)果：兩側(cè)植骨床可見完整但排列紊亂的小梁骨結(jié)構(gòu)，其中既有骨性連接也有纖維組織連接，無明顯血管化。E組結(jié)果：同D組結(jié)果，但小梁骨長入較多。

2.6 掃描電鏡 術(shù)后8周，5組標(biāo)本均進(jìn)行掃描電鏡的觀察，B組支架和骨組織整合緊密，部分區(qū)域降解明顯。C組材料較多降解吸收，內(nèi)部均已形成骨樣組織，以纖維成骨和軟骨成骨為主，其中C、D、E組明顯優(yōu)于A、B組。

3 結(jié)論

本研究以一種新型納米骨可注射骨修復(fù)材料為支架，ADMSCs作為種子細(xì)胞，中藥骨碎補(bǔ)總黃酮灌胃進(jìn)行兔脊柱融合的實(shí)驗(yàn)研究，本研究顯示C、D、E組獲得較好的融合率，顯著高于單純IRBC，IRBC+ACB（P＜0.05）；C、E組融合率要優(yōu)于D組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這個結(jié)果表明IRBC材料復(fù)合ADMSCs可以形成骨組織，并與植骨床整合良好，結(jié)合中藥AFDR灌胃，可以提高脊柱的骨性融合率。

4 討論

隨著生命科學(xué)和材料工程等學(xué)科快速交叉發(fā)展，構(gòu)建體外有生命力的組織工程化骨是修復(fù)骨缺損的熱點(diǎn)和未來趨勢［5-6］。清華大學(xué)生物材料研究組自組裝成具有天然骨分級結(jié)構(gòu)和特性的海藻酸基可注射骨修復(fù)材料。它與天然骨的高相似性決定了其用于骨修復(fù)材料的優(yōu)越性，是一種理想的骨修復(fù)材料［7-8］。同時材料可添加生長因子使材料具有誘導(dǎo)成骨性能，并通過平衡材料使新骨成骨速度和材料降解吸收速度匹配，具有良好的生物相容性，以此為基礎(chǔ)制備微創(chuàng)原位成型可注射生物材料，既可以保持仿天然骨結(jié)構(gòu)的特征，又賦予了材料新的可注射性能，具有更大的應(yīng)用范圍，是對骨缺損治療方法的變革，具有廣闊的應(yīng)用的前景［9］。

李晉玉等［10］發(fā)現(xiàn)不同濃度的骨碎補(bǔ)提取液對培養(yǎng)細(xì)胞的作用結(jié)果截然不同，高濃度對細(xì)胞有破壞作用，而中、低濃度卻具有一定的促進(jìn)分化作用。在體外骨細(xì)胞培養(yǎng)，證明AFDR能促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性和增殖，增加骨形成，提高骨密度，維持骨微結(jié)構(gòu)的完整程度［11-12］。

對于脊柱融合的實(shí)驗(yàn)，國際上并沒有一個公認(rèn)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。取材的時間點(diǎn)集中在術(shù)后8～10周［13-15］，本實(shí)驗(yàn)采用術(shù)后8周，處死動物，采集標(biāo)本，并應(yīng)用多項(xiàng)指標(biāo)評價移植后是否發(fā)生了骨性融合。本研究表明，IBRC材料單獨(dú)植入8周時均未融合，組織學(xué)觀察成骨效果亦不如自體骨，說明IBRC材料本身雖具有仿生骨的構(gòu)架，但在沒有復(fù)合骨誘導(dǎo)因子、成骨細(xì)胞的情況下，其優(yōu)點(diǎn)僅是快速生物降解性、優(yōu)良骨相容性、高效的骨傳導(dǎo)性，其成骨效果不如IBRC材料+ADMSCS和ACB組。ACB+AFDR組證明其融合效果略優(yōu)于ACB+DW組，說明骨碎補(bǔ)總黃酮能夠提高融合率。IBRC材料復(fù)合ADMSCS應(yīng)用，因含誘導(dǎo)成骨因子［16-17］，成骨作用明顯優(yōu)于單獨(dú)IBRC材料［18］。B組實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明IBRC材料與ADMSCS有良好的復(fù)合性，兩者復(fù)合使IBRC材料更有利于被機(jī)體降解、利用、成骨。臨床中IBRC材料與ADMSCS復(fù)合在一定情況下可替代自體骨的應(yīng)用。

總之，IBRC材料具有無免疫原性、快速生物降解性、優(yōu)良骨相容性、高效的骨傳導(dǎo)性，與ADMSCS有良好的復(fù)合性、成骨效率更高，便于修整以適合脊柱融合，是優(yōu)良的骨替代生物材料［19-21］。AFDR不僅具有促進(jìn)成骨作用，還有改善血循環(huán)的作用，可以促進(jìn)橫突間融合的速度及質(zhì)量，雖然遜于材料復(fù)合ADMSCS的效果，但從安全、經(jīng)濟(jì)以及對骨質(zhì)疏松的改善作用等方面考慮，仍有其進(jìn)一步研究的價值。

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（2013-11-12收稿）

Research on the Im pact of Herbal Extracts AFDR Combined w ith IBRC and ADMSCs used for Rabbit Lumbar Transverse Interbody Fusion

Li Jinyu1，Xu Lin1，Jin He2，Tan Rong-wei3，3，Yu Xing1
（1 Department of Orthopedics，Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China；2 Department of Orthopedics，Yanqing Chinese Medicine Hospital，Beijing 102100，China；3 Department of Materials Science，Tsinghua University，Beijing 100086，China；4 Shenzhen Lando Biological Material Co．，Shenzhen 518057，China）

Objective：To explore the effect of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal cells（ADMSCs）which is Injectable Bone Regeneration Composite（IBRC）combined with intra-gastric administration of Assemble Flavone of Drynaria Rhizome（AFDR）on rabbitswith lumbar transverse interbody fusion.Methods：Sixty adult rabbitsweremade into rabbit lumbar transverse interbody fusionmodels，random ly divided into five groups including A group（IBRC+AFDR），B group（IBRC+Autologous iliac Crest Bone（ACB）+Deionized Water（DW）），C group（IBRC+ADMSCs+DW），D group（ACB+DW），E group（ACB+AFDR）.After eightweeks of treatment，specimens were collected for gross observation，touch detection，X-ray，histological observation.Results：The fusion rates ofgroup C and group E were significantly higher than that of group B（P＜0.05），and there was no significantly statistical difference（P＞0.05）compared with the group D.Conclusion：IRBC composite ADMSCs can achieve a similar fusion rate as ACB group.Combingwith traditional Chinese AFDR can improve the rate of the intertransverse lumbar fusion in rabbits.

Adipose-derived mesenchymal stem cells；Rabbit；Lumbar transverse interbody fusion；Injectable bone regeneration composite；Assemble flavone of drynaria rhizome

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.12.024

北京中醫(yī)藥大學(xué)青年教師資助計劃；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃基金項(xiàng)目（編號：NCET-10-0249）

俞興（1972.11—），男，博士后，博士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，副教授，研究方向：脊柱脊髓損傷與疾病，骨組織工程