何玉仙，黃炯，張讀樸，陳宏，余洪磊

（1.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏魯木齊830032；2.新疆畜牧科學院，新疆 烏魯木齊830000）

裂解血球全血與健康動物血清在牛多殺性巴士桿菌病滅活疫苗生產中使用效果對比試驗

何玉仙1，黃炯2，張讀樸1，陳宏1，余洪磊1

（1.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏魯木齊830032；2.新疆畜牧科學院，新疆 烏魯木齊830000）

獸用生物制品制造及檢驗規(guī)程中規(guī)定：牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗在通氣培養(yǎng)過程中，需添加0.1%裂解血球全血。本試驗通過在合成培養(yǎng)基中添加裂解血球全血與健康動物血清培養(yǎng)對比，發(fā)現(xiàn)在牛多殺性巴士桿菌病滅活疫苗生產中添加一定量健康動物血清，其生長菌數(shù)、效力檢驗、安全檢驗均與添加0.1%裂解血球全血生產檢驗指標相一致，且有降低污染率、降低生產成本的效果，值得生產中推廣使用。

裂解血球全血；健康動物血清；安全檢驗；效力檢驗；生產成本

獸用生物制品制造及檢驗規(guī)程中規(guī)定牛多殺性巴士桿菌病滅活苗生產培養(yǎng)基中需添加0.1%的裂解血球全血進行通氣培養(yǎng)[1]。本試驗目前所采用的方法是：采羊頸部動脈全血做裂解血球。在采集羊血中不僅需要確保操作人員及環(huán)境的潔凈，而且還要確保羊只健康，血液中不帶病菌及病毒，才能保證培養(yǎng)基中添加裂解血球全血培養(yǎng)出的菌液質量合格。這使得生產和采購人員的勞動強度增大，同時污染幾率也變大，而目前市場上可以買到大量健康無菌的犢牛血清，添加健康犢牛血清造成菌液污染的幾率較羊血減小。本試驗用不同含量的羊裂解血球全血與健康犢牛血清比較通氣培養(yǎng)的效果，嘗試用健康犢牛血清代替羊裂解血球全血進行生產[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裂解血球全血

本試驗所用綿羊購自新疆米泉市，無菌方式采集綿羊鮮血，加入已滅菌的抗凝劑瓶中，經-15℃凍融兩次而得。

抗凝劑配制：檸檬酸0.65 g;檸檬酸鈉16 g;葡萄糖41 g;氯化鈉8.4 g，加入蒸餾水1 L配制而得，每10 L血清瓶中裝600 mL抗凝劑，用于采一只羊的血量。

1.1.2 健康犢牛血清

蘭州民海生物或內蒙金源康生物制品廠提供，500 mL/瓶。

1.1.3 消泡劑

金龍魚或其他品牌食用調和油適量。

1.1.4 主要器材和設備

1 mL吸管，10 mL吸管，吸耳球，平皿，15＃試管，恒溫培養(yǎng)箱（由中國南京恒裕電子儀器廠制造，型號HP-300A）。

1.1.5 試驗動物

家兔、小白鼠均為本公司品管部動物房提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 生產種子制備

（1）一級種子繁殖及鑒定將各株凍干菌種分別接種于含0.1%裂解血球全血的馬丁肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h，然后按其培養(yǎng)特性的標準要求，每株挑選5個以上典型菌落，分別接種于鮮血瓊脂斜面若干支，37℃培養(yǎng)24 h，作為一級種子。在2℃～8℃保存。

（2）二級種子繁殖將各株一級種子分別接種于含0.1%裂解血球全血的馬丁肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h后，分別取樣用馬丁瓊脂做純粹檢驗；置2℃～8℃保存。

1.2.1.2 制苗用培養(yǎng)基

使用的是車間自制復合培養(yǎng)基，其主要成分為氯化鈉、酵母浸出粉、蔗糖和酪蛋白胨[3]。

1.2.1.3 制苗用菌液制備

（1）菌液培養(yǎng)將各級二級種子菌液等量混合，按培養(yǎng)基總量的1%～2%接種二級種子液，并分別按0.15%、0.10%、0.05%含量添加綿羊裂解血球全血及適量消泡劑，按0.4%、0.2%、0.13%的比例添加健康犢牛血清及適量消泡劑，以逐漸增加通氣量的方法，在37℃培養(yǎng)16～18 h。

（2）培養(yǎng)生長均在本公司生產車間負壓滅活菌苗生產線反應間的3個反應罐中進行，各反應罐培養(yǎng)基量均為1 300 L，3個反應罐通氣量大小、反應時間和消泡劑使用量均相同。

（3）培養(yǎng)生長分三次進行，第一次為添加不同含量的裂解血球全血3個反應罐37℃培養(yǎng)；第二次為添加不同含量的健康犢牛血清3個反應罐37℃培養(yǎng)；第三次為添加一罐為0.05%綿羊裂解血球全血，兩罐為0.13%健康犢牛血清37℃培養(yǎng)。

（4）純粹檢驗及活菌計數(shù)菌液培養(yǎng)完成后，每罐分別取樣，用馬丁瓊脂作純粹檢驗；并用含0.1%裂解血球全血及4%健康動物血清的改良馬丁瓊脂平板作活菌計數(shù)，作為配苗參考。

1.2.2 滅活、配苗、半成品檢驗、分裝

均按獸用生物制品制造及檢驗規(guī)程中規(guī)定制造[1]。

1.3 效力檢驗[1]

用體重1.5～2.0 kg家兔4只，各皮下或肌肉注射疫苗1 mL，14～21 d后連同條件相同的對照兔2只，各皮下或肌肉注射致死量的C45～2強毒菌液，觀察8 d，對照兔應全部死亡，免疫兔至少保護2只。

1.4 安全檢驗[1]

用體重1.5～2.0 kg家兔2只，分別皮下注射疫苗5 mL；同時用體重18～22 g小白鼠5只，分別皮下注射疫苗0.3 mL，觀察10 d，應全部健活。

2 試驗結果

2.1 不同含量裂解血球全血及健康動物血清培養(yǎng)效果對比（見表1、表2、表3）

表1 添加不同含量裂解血球全血培養(yǎng)效果對比

表2 添加不同含量健康動物血清培養(yǎng)效果對比

表3 添加不同含量裂解血球全血及健康動物血清培養(yǎng)效果對比

2.2 添加不同含量裂解血球全血與健康動物血清直接生產成本對比（見表4）

表4 添加不同裂解血球全血與健康犢牛血清直接生產成本對比

3 討論

合成培養(yǎng)基中添加羊裂解血球全血含量在0.05%～0.15%之間，在通氣培養(yǎng)條件不變的情況下，細菌生長數(shù)量、效力檢驗、安全檢驗差別不明顯，均符合獸用生物制品制造規(guī)程規(guī)定。

合成培養(yǎng)基中添加健康犢牛血清含量在0.13%～0.4%之間，在通氣培養(yǎng)條件不變的情況下，細菌生長數(shù)量、效力檢驗、安全檢驗差別不明顯，均符合獸用生物制品制造規(guī)程規(guī)定。

在合成培養(yǎng)基中添加不同含量的羊裂解血球全血與健康犢牛血清，在通氣培養(yǎng)條件不變的情況下，其細菌生長數(shù)量差別不明顯，其效力檢驗均在2/4～3/4之間，安全檢驗無論是家兔還是小白鼠均健活，符合獸用生物制品制造規(guī)程規(guī)定，此試驗表明實際生產中無論在培養(yǎng)基中使用羊裂解血球全血，還是使用健康犢牛血清均不影響產品質量，可達到相同免疫效果。

添加含量在0.05%與0.13%、0.1%與0.2%、0.15%與0.4%的羊裂解血球全血與健康犢牛血清在單位生產成本上差別不明顯，屬于生產可接受范圍。目前本公司采購的健康犢牛血清生產廠家全部除菌過濾，保證了犢牛血清質量，營養(yǎng)成分好，無污染，因使用方便，無人工采血的成本，避免了采集羊血過程中可能造成的污染，降低了人工勞動強度，生產上值得推廣。

[1]中華人民共和國農業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程2000版[M].北京：化學工業(yè)出版社:25-26.

[2]陳天壽.微生物培養(yǎng)基制造與應用[M].北京:中國農業(yè)出版社，1995.

[3]張讀樸，孟建國，黃炯，等.一種經改良的培養(yǎng)基替代馬丁肉湯培養(yǎng)基生產牛多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗的試驗[C].中國微生物學會獸醫(yī)微生物學專業(yè)委員會學術研討會論文集，北京:中國畜牧獸醫(yī)學會生物制品學分會,2007,642-643.

Compare the Effect of Whole Blood with Lysed Blood Cells and Healthy Animal Serum on the Production of Cattle Pasteurellamultocid Vaccine

HE Yu-xian1，HUANG Jiong2，ZHANG Du-pu1，CHEN Hong1，YU Hong-lei1
（1.Xinjiang Tiankang Animal Husbandry Biotechnology Limited Liability Company，Urumqi 830032,China; 2.Xinjiang Academy of Animal Science，Urumqi 830000，China）

Veterinary Biologics products industry and inspection procedures provided that:0.1%whole blood with lysed blood cells was needed to add in aerobic culture of bovine pasteurellamultocida inactivated vaccinen.This test compare synthetic medium which was added whole blood with the medium with healthy animal serum-free culture,we found that there are consistent results in the production of cattle Pasteurellamultocid vaccine by adding a certain amount of healthy animal serum in cattle or 0.1%cleavage blood cell.And this method could lower pollution rate,reduce production costs,so it’s worth to use widely.

cracking of blood cells in whole blood;healthy animal serum;safety inspection;potency test;cost of production

S852.5

A

1003－6377（2013）03－0044-04

2013-02-18

何玉仙（1967-），女，獸醫(yī)師，一直從事獸用疫苗的生產及管理工作。