王金雷，陳格飛，李 佳，林 瑛，孟 清

（東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620）

悅目金蛛絲蛋白TuSp1重復(fù)模塊特征

王金雷，陳格飛，李 佳，林 瑛，孟 清

（東華大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 201620）

針對(duì)蜘蛛管狀腺絲蛋白（TuSp）結(jié)構(gòu)進(jìn)行克隆和分析，基于悅目金蛛（Argiopeamoena，A.amoena）管狀腺總RNA，利用簡(jiǎn)并引物和巢式聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)克隆Aa TuSp1編碼基因序列1 273 bp，其包含3個(gè)重復(fù)單元，每個(gè)重復(fù)單元編碼176個(gè)氨基酸，重復(fù)單元之間的序列同源性高達(dá)97%以上，且富含丙氨酸（Ala）和絲氨酸（Ser），其次是甘氨酸（Gly），組成了一系列Poly T，Poly A，PolyS，SQ和GX模體結(jié)構(gòu)，推測(cè)與其獨(dú)特的力學(xué)性能相關(guān).系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，不同于典型蛛絲蛋白MaSp，F(xiàn)lag等，Aa TuSp1及近系包卵絲蛋白形成一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支.研究結(jié)果為基于TuSp1合成仿生蛛絲提供了新的結(jié)構(gòu)基因藍(lán)圖.

悅目金蛛；管狀腺絲蛋白；重復(fù)單元；巢式聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）；進(jìn)化

蜘蛛絲是一類具有優(yōu)良力學(xué)性能和生物學(xué)特性的天然蛋白聚合纖維，在紡織、生物醫(yī)學(xué)、軍工及航空航天等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景和巨大的商業(yè)價(jià)值［13］.蜘蛛在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，保留著包裹蛛卵的由包卵絲組成的卵袋結(jié)構(gòu)，用于保護(hù)蛛卵免受外侵.其中，管狀腺分泌的管狀腺絲蛋白（tubuliform spidroin，TuSp）經(jīng)噴絲器合成蛛絲，構(gòu)成卵袋外層［46］.迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)一種管狀腺絲蛋白，即TuSp1，預(yù)測(cè)分子量超過(guò)300 k Da（編碼基因長(zhǎng)約12 kb），但結(jié)構(gòu)解析尚未完成［7］.鑒于最具代表性的園蛛科蜘蛛絲蛋白結(jié)構(gòu)（尤其是包卵絲蛋白）現(xiàn)較少報(bào)道［810］，亟待解析，國(guó)內(nèi)也多局限在絲纖維力學(xué)性能研究［1112］，未見(jiàn)絲蛋白結(jié)構(gòu)方面的報(bào)道.本文主要針對(duì)蜘蛛管狀腺絲蛋白（TuSp1）進(jìn)行基因克隆和分析.首先基于悅目金蛛（A.amoena）管狀腺總RNA，利用簡(jiǎn)并引物和巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技 術(shù) 克 隆Aa TuSp1部分編碼基因序列，然后經(jīng)序列比對(duì)分析其模塊特征，再經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析，證實(shí)Aa TuSp1及其近系包卵絲蛋白作為一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，分布于典型蛛絲蛋白（網(wǎng)捕絲，如 MaSp和Flag等）之外，是蜘蛛絲蛋白基因家族的新成員.

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

悅目金蛛采集于上海松江區(qū)周邊，Trizol?試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，USA），PCR克隆試劑盒（CloneJETTMPCR Cloning Kit）、長(zhǎng)片段擴(kuò)增聚合酶（Long PCR Enzyme Mix），引物合成委托上海英駿生物技術(shù)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 蜘蛛管狀腺體分離及其總RNA提取

選取適于解剖的成熟蜘蛛個(gè)體，經(jīng)CO2麻醉后活體解剖獲取管狀絲腺，解剖緩沖液參考文獻(xiàn)［13］配制，液氮冰凍并置于-80℃保存?zhèn)溆?管狀腺總RNA提取采用Trizol一步法（參照Trizol?試劑說(shuō)明書），總RNA置于-80℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)及其PCR驗(yàn)證試驗(yàn)

鑒于文獻(xiàn)［8］報(bào)道蜘蛛包卵絲蛋白為單一外顯子編碼蛋白質(zhì)，本文基于已報(bào)道序列保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，并利用基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證試驗(yàn).根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道的3條蜘蛛管狀腺絲蛋白序列：銀金蛛 （A.argentata）TuSp1 （基 因 登 錄 號(hào)：AAY28932）、橫紋金蛛（A.bruennichi）ECP1（基因登錄號(hào)：BAE86855）、蔽日蛛（A.aurantia）TuSp（基因登錄號(hào)：AAX45292），經(jīng)Blockmaker（http：／／blocks.fhcrc.org／blocks／make＿blocks.html）比對(duì)，得到高度保守的連續(xù)氨基酸區(qū)域；登陸Code Hop數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／blocks.fhcrc.org／codehop.html）進(jìn)行簡(jiǎn)并引物搜索，參數(shù)設(shè)置為 Maximum core degeneracy：64；Target clamp temperature：60 ℃；Genetic code：standard；Codon usage table：Bombyx mori，Codon usage table一項(xiàng)選用與蜘蛛相似的家蠶作為參考，并結(jié)合對(duì)上述3條序列重復(fù)單元的分析，篩選出1對(duì)簡(jiǎn)并引物，如表1所示.

通過(guò)改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法分離悅目金蛛高質(zhì)量基因組DNA（genomic DNA，gDNA）［14］.以gDNA稀釋產(chǎn)物為模板，結(jié)合簡(jiǎn)并引物進(jìn)行簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增，克隆測(cè)序目的產(chǎn)物得到一條282 bp DNA序列.經(jīng)Blast N在線同源比對(duì)分析，確定該序列為悅目金蛛包卵絲蛋白TuSp1部分編碼序列.根據(jù)該DNA序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物，如表1所示，以備后用.

表1 簡(jiǎn)并引物列表Table 1 Degenerate primers

1.2.3 管狀腺絲蛋白TuSp1基因克隆與測(cè)序分析

以管狀腺腺體總RNA為模板，Outer Primer為反 轉(zhuǎn) 錄 引 物，利 用 M-MLV（Moloney Murine Leukemia Virus）逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.反轉(zhuǎn)錄體系為20μL，反應(yīng)條件為70℃，10 min；冰上急冷；42℃，1 h；70℃，10 min；以引物S1和Outer Primer為上下游引物進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系為L(zhǎng)ong PCR Enzyme Mix操作體系（50μL），反應(yīng)條件為94℃，預(yù)變性2 min；然后90℃，40 s；50℃，30 s；68℃，1.5 min，10個(gè)循環(huán)，再經(jīng)過(guò)90℃，40 s；55℃，30 s，68℃，1.5 min，25個(gè)循環(huán)，其中68℃處理時(shí)每一循環(huán)增加5 s，最后68℃，10 min.以第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以引物S1和Inner Primer為上下游引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系同第一輪，反應(yīng)條件為94℃，預(yù)變性2 min；然后90℃，40 s；55℃，30 s；68℃，1.5 min，30個(gè)循環(huán)，最后68℃，10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收，克隆入pJET1.2／blunt cloning vector（CloneJETTMPCR Cloning Kit）送北京華大基因研究中心測(cè)序分析.

1.2.4Aa TuSp1序列比對(duì)與進(jìn)化分析

首先，基于Blast X平臺(tái)檢索NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，隨后利用BLASTCLUST鑒定試驗(yàn)獲得A.amoenaTuSp1編碼基因序列為非冗余序列.然后，利用 EMBOSS程序（equicktandem／etandem）檢索重復(fù)單元［15］.由DNAMAN V 5.2.2軟件完成氨基酸序列預(yù)測(cè)和氨基酸組成分析工作.

對(duì)本文發(fā)現(xiàn)的A.amoenaTuSp1序列及文獻(xiàn)［16］報(bào)道的蛛絲蛋白cDNA序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，采用 MEGA V5.0軟件［17］進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.

2 研究結(jié)果與討論

2.1 AaTuSp1重復(fù)模塊序列克隆與序列分析

本文利用巢式PCR擴(kuò)增獲取一條悅目金蛛管狀腺絲蛋白編碼基因序列1 273 bp（基因登錄號(hào)：JQ291306），驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)包含1.2.2節(jié)中得到的282 bp DNA序列.在線比對(duì)分析確定其為TuSp1部分cDNA序列，命名為Aa TuSp1.預(yù)測(cè)氨基酸序列如圖1所示.其中，粗體和白體表示不同重復(fù)單元；下劃線表示GX（X代表N，F(xiàn)，T，L，I等氨基酸）和Poly T重復(fù)模塊.編碼氨基酸序列長(zhǎng)度由424個(gè)氨基酸殘基組成，包含3個(gè)重復(fù)單元，每個(gè)重復(fù)單元528 bp（編碼176個(gè)氨基酸），重復(fù)單元之間的序列同源性高達(dá)97%以上.

以Aa TuSp1重復(fù)單元為參照，利用Blast P進(jìn)行GenBank非冗余蛋白庫(kù)同源搜索比對(duì).借助同源分析結(jié)果，對(duì)與A.amoena近源的3種蜘蛛（A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus）的TuSp1進(jìn)行重復(fù)單元的劃分，A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus的重復(fù)單元分別由180，180和184個(gè)氨基酸組成，均大于A.amoena包卵絲蛋白Aa TuSp1的重復(fù)單元（176個(gè)）.現(xiàn)有研究表明，蛛絲蛋白主要由4種典型的重復(fù)模塊組成：An，（GA）n，（GGX）n和 GPGXn，因此甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）含量較高［1819］.利用DNAMAN軟件對(duì)A.amoena，A.argentata，A.bruennichi和L.hesperus重復(fù)單元進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，4種蜘蛛的重復(fù)單元均富含Ala和絲氨酸（Ser），且Gly，Ser和Ala含量均高于25%，其氨基酸組成均不同于典型的蛛絲蛋白，并組成了一系列Poly T，Poly A，PolyS，SQ和GX模體結(jié)構(gòu)，推測(cè)與其獨(dú)特的力學(xué)性能和生物學(xué)特性相關(guān).和SOPMA算法）對(duì)該重復(fù)單元進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，均證實(shí)大多數(shù)氨基酸折疊成Helix結(jié)構(gòu)，僅有很少的氨基酸形成Strand結(jié)構(gòu).由于βsheet結(jié)構(gòu)與蛛絲纖維的強(qiáng)度相關(guān)，Helix與延展性對(duì)應(yīng)，因此這種富含Helix結(jié)構(gòu)、缺少Strand結(jié)構(gòu)可以用于解釋包卵絲蛋白的低強(qiáng)度和高延伸性，但包卵絲蛋白TuSp1的氨基酸組成和折疊結(jié)構(gòu)與包卵絲纖維的力學(xué)性能和生物學(xué)特性還有待更深層的研究［25］.

圖1 AaTuSp1預(yù)測(cè)氨基酸序列分析Fig.1 Analysis of predicted amino acid sequence of AaTuSp1

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，TuSp1與拖絲蛋白（MaSp）和鞭毛狀絲蛋白（Flag）分別位于不同的節(jié)點(diǎn)之內(nèi)，如圖4所示，這表明包卵絲蛋白是一個(gè)新的絲蛋白亞家族.本文發(fā)現(xiàn)的Aa TuSp1將為合成仿生蛛絲提供了新的結(jié)構(gòu)基因藍(lán)圖.

3 結(jié) 語(yǔ)

（1）由于重復(fù)單元及其內(nèi)部重復(fù)模體的頻繁出現(xiàn)，常規(guī)PCR方法獲取蜘蛛管狀腺絲基因無(wú)法獲得理想效果，因此成為仿生蛛絲的瓶頸.本文采用簡(jiǎn)并引物與巢式PCR相結(jié)合的方法為蛛絲蛋白基因的獲取提供了新思路.

（2）本文發(fā)現(xiàn)的Aa TuSp1具有穩(wěn)定的均勻序列重復(fù)特性，重復(fù)單元之間同源性高達(dá)97%以上，這種結(jié)構(gòu)模式與傳統(tǒng)的蛛絲蛋白（如拖絲和鞭毛狀絲等）不同.

（3）系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，包卵絲蛋白是一個(gè)新的絲蛋白亞家族，這為后續(xù)的人工仿生蛛絲提供了基因藍(lán)圖.

［1］VOLLRATH F，KNIGHT D P.Liquid crystalline spinning of spider silk［J］.Nature，2001，410（6828）：541-548.

［2］VEPARI C，KAPLAN D L.Silk as a biomaterial［J］.Prog Polym Science，2007，32（8／9）：991-1007.

［3］KLUGE J A，RABOTYAGOVA O，LEISK G G，et al.Spider silks and their applications［J］.Trends Biotechnol，2008，26（5）：244-251.

［4］HU X，VASANTHAVADA K，KOHLER K，et al.Molecular mechanisms of spider silk ［J］.Cell Mol Life Sci，2006，63（17）：1986-1999.

［5］GUERETTE P A，GINZINGER D G，WEBER B H，et al.Silk properties determined by gland-specific expression of a spider fibroin gene family［J］.Science，1996，272（5258）：112 115.

［6］CANDELAS G C，ORTIZ A，MOLINA C.The cylindrical or tubiliform glands of nephila clavipes［J］.J Exp Zool，1986，237（2）：281-285.

［7］LIN Z，HUANG W，ZHANG J，et al.Solution structure of eggcase silk protein and its implications for silk fiber formation［J］.Proc Natl Acad Sci，2009，106（22）：8906-8911.

［8］GARB J E，HAYASHI C Y.Modular evolution of egg case silk genes across orb-weaving spider superfamilies ［J］.Proc Natl Acad Sci，2005，102（32）：11379-11384.

［9］HU X，LAWRENCE B，KOHLER K，et al.Araneoid egg case silk：A fibroin with novel ensemble repeat units from the black widow spider，Latrodectus hesperus［J］.Biochemistry，2005，44（30）：10020-10027.

［10］TIAN M，LEWIS R V. Molecular characterization and evolutionary study of spider tubuliform （eggcase）silk protein［J］.Biochemistry，2005，44（22）：8006-8012.

［11］潘志娟，李春萍，劉敏，等.大腹圓蛛包卵絲的化學(xué)組成與物理機(jī)械性能 ［J］.東華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，28（4）：34 39.

［12］張長(zhǎng)勝，潘志娟，夏艷杰，等.納米再生蜘蛛包卵絲的紡制及其結(jié)構(gòu)與性能 ［J］.絲綢，2006（1）：16-19.

［13］JEFFERY F，LA MATTINA C，TUTON-BLASINGAME T，et al.Microdissection of black widow spider silk-producing glands［J］.J Vis Exp，2011，47：1-6.

［14］張?jiān)讫?，陳格飛，陳國(guó)亮，等.大腹圓蛛Fosmid文庫(kù)的構(gòu)建及MaSp基因篩選方法的探討 ［J］.生命科學(xué)研究，2010，14（1）：21-26.

［15］RICE P， LONGDEN I， BLEASBY A. EMBOSS： the European molecular biology open software suite［J］.Trends Genet，2000，16：276-277.

［16］THOMPSON J D，HIQQINS D G，GIBSON T J.CLUSTAL W：Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice ［J］.Nucleic Acids Res，1994，11（22）：4673-4680.

［17］TAMURA K，PETERSON D， PETERSON N，et al.SMEGA 5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods ［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

［18］GATESY J，HAYASHI C，MOTRIUK D，et al.Extreme diversity，conservation，and convergence of spider silk fibroin sequences［J］.Science，2001，291（5513）：2603.

［19］HAYASHI C Y，LEWIS R V.Molecular architecture and evolution of a modular spider silk protein gene［J］.Science，2000，287（5457）：1477-1479.

［20］BITTENCOURT D，SOUTO B M，VERZA N C，et al.Spidroins from the Brazilian spider nephilengys cruentata（Araneae：Nephilidae）［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2007，147（4）：597-606.

［21］HAYASHI C Y， BLACKLEDGE T A， LEWIS R V.Molecular and mechanical characterization of aciniform silk：Uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family［J］.Mol Biol Evol，2004，21（10）：1950-1959.

［22］GELLYNCK K， VERDONK P， FORSYTH R，et al.Biocompatibility and biodegradability of spider egg sac silk［J］.J Mater Sci Mater Med，2008，19（8）：2963-2970.

［23］VINEY C.From natural silks to new polymer fibres ［J］.Journal of the Textile Institute，2000，91（3）：2-23.

［24］ZHAO A C，ZHAO T F，NAKAGAKI K，et al.Novel molecular and mechanical properties of egg case silk from wasp spider，Argiope bruennichi［J］.Biochemistry，2006，45（10）：3348-3356.

［25］HAYASHI C Y，SHIPLEY N H，LEWIS R V.Hypotheses that correlate the sequence， structure， and mechanical properties of spider silk proteins ［J］.Int J Biol Macromol，1999，24（2／3）：271-275.

Characterization of Spidroin TuSp1 Repeat Module fromArgiopeAmoena

WANGJin-lei，CHENGe-fei，LIJia，LINYing，MENGQing

（Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China）

Cloning and structural analysis of tubuliform spidroin（TuSp）were performed based on the extraction of total RNA ofArgiopeamoenatubuliform，degenerate primers and the technique of nested polymerase chain reaction（PCR）were used to obtainAa TuSp1，which was 1 273 basepairs，and included three repeats.Each repeat contained 176 amino acids，and among these repeats，the identity was up to 97%.The sequence was rich in Ala，Ser and Gly，and formed a series of motifs，such as Poly T，Poly A，PolyS，SQ and GX，which may be related with the mechanical characterization.Phylogenetic analysis demonstrated that AaTuSp1 formed a new branch that was different from MaSp，F(xiàn)lag and so on.The research results provided a new gene blueprint for biomimicing spider silk.

Argiopeamoena；tubuliform spidroin；repeat unit；nested polymerase chain reaction（PCR）；evolution

Q 78

A

2012 02 06

國(guó)家“八六三”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2006AA03Z451）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31070698）；上海市基礎(chǔ)研究重點(diǎn)資助項(xiàng)目（10JC1400300）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20120075110007）

王金雷（1986—），男，上海人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹虢z蛋白基因的克隆及表達(dá).E-mail：leow＠m(xù)ail.dhu.edu.cn

孟 清（聯(lián)系人），男，教授，E-mail：mengqing＠dhu.edu.cn

1671-0444（2013）02-0196-06