雷雅靜，朱銀煥，施衛(wèi)星，那仁滿都拉，陳樞青

(1.浙江大學(xué)藥學(xué)院藥理毒理與生化藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310058;2.杭州愛貝亞檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310051;3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，浙江 杭州 310058)

科技的發(fā)展，工業(yè)的進(jìn)步在給人們的生活帶來極大便利的同時，也帶來前所未有的環(huán)境污染，嚴(yán)重影響、威脅著國民的健康水平和生命質(zhì)量。多項(xiàng)研究表明，近些年來我國多種嚴(yán)重疾病的發(fā)生率、癌癥死亡率持續(xù)上升，而環(huán)境污染是引起這些現(xiàn)象的重要原因之一?？諝?、水和食物等環(huán)境介質(zhì)中的污染物含量被稱為外暴露水平，而個體生物樣本如血液、尿液等中的污染物含量被稱為內(nèi)暴露水平，或者稱為“體內(nèi)負(fù)荷”。由于個體之間具有不同的生活方式和遺傳因素，造成在同樣的環(huán)境下，體內(nèi)可以有不同劑量的污染物，造成的健康危害風(fēng)險也存在差異，因此對環(huán)境污染物進(jìn)行內(nèi)暴露水平的檢測具有更重要的意義［1］。

為了研究 TMT、CPZ、PCBs、DBP、4，5-DCC、甲醛、甲苯、磷酸二甲酯(DMP)、磷酸二乙酯(DEP)、硫代磷酸二乙酯(DETP)、二硫代磷酸二乙酯(DEDTP)、AFM1等環(huán)境污染物的內(nèi)暴露水平，本研究通過GC-MS、HPLC和ELISA等方法對多種環(huán)境污染物的人體內(nèi)暴露水平進(jìn)行測定，直接顯示個體的環(huán)境污染物的水平，為研究內(nèi)暴露水平及其對人體健康的影響奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 標(biāo)準(zhǔn)品三甲基氯化錫和鹽酸氯丙嗪、鄰苯二甲酸二丁酯購于美國SIGMA，二惡英代謝物購于德國DR公司，磷酸二甲酯購于比利時ACROS公司，磷酸二乙酯、硫代磷酸二乙酯、二硫代磷酸二乙酯購于美國ALDRICH公司，磷酸二丁酯、黃曲霉毒素、甲醛、甲苯、多氯聯(lián)苯購于美國FLUKA;衍生化試劑五氟溴芐苯(PFBBr)、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、五氟丙酸酐(PFPA)購于美國FLUKA;內(nèi)標(biāo):二苯胺、苯甲酮、納多絡(luò)爾(NAL)購于美國SIGMA。檢測樣品隨機(jī)收集于醫(yī)院體檢時的正常人尿樣。樣本取回后離心取上清，保存于－20℃。

1.2 主要儀器設(shè)備 Agilent 6890GC/5975MS聯(lián)用儀，配有 EI源和自動進(jìn)樣器;Agilent 6890N氣相色譜儀，配自動進(jìn)樣器，F(xiàn)ID、NPD檢測器;Agilent G1888A頂空進(jìn)樣儀，HP ChemStations軟件;Agilent1100高效液相色譜儀，G1354四元泵，柱溫箱，自動進(jìn)樣器，Agilent化學(xué)工作站，紫外、熒光檢測器;Supelco 12孔SPE固相萃取儀，杭州德佳科學(xué)儀器有限公司;電子天平 AL104，上海第二天平廠;Anke TDL80-2B離心機(jī) ，美國BECKMAN公司;WH-861蝸旋儀，江蘇泰昌;吹干儀，DHG-9123A干燥箱，DK-8D型恒溫水浴鍋，上海精宏。

1.3 樣本收集 于2009年9月，在受檢者知情同意的情況下，本實(shí)驗(yàn)組收集了浙江省臺州市80例體檢者的晨尿或停止飲水2 h后的隨機(jī)尿。受檢者年齡在18～65歲之間，為非職業(yè)性、非事故性接觸所測污染物質(zhì)的樣本。所有尿樣離心后取上清保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 GC法檢測尿樣中幾種環(huán)境污染物的含量

2.1.1 GC/MS法檢測尿樣中三甲基氯化錫、鹽酸氯丙嗪的含量 樣品預(yù)處理:吸取尿樣10 ml于萃取瓶中，加氯化鈉3 g，5%NaOH 200 μl，調(diào)節(jié)pH 約8.5，再加入乙酸乙酯10 ml進(jìn)行萃取，1500 r/min蝸旋5 min后，3000 r/min離心4 min，吸出有機(jī)相，加入5 g無水硫酸鈉除水，常溫常壓下用氮?dú)鉂饪s，定容至500 μl進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量1 μl。色譜條件:色譜柱為DB-5MS(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣口溫度:280℃;程序升溫:初始溫度60℃，保持2 min，以10℃/min升至80℃，然后40℃/min升至270℃，再5℃/min至280℃，保持5 min。以10/1分流比進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μl;載氣為高純氦氣，流速1.0 ml/min;EI離子源，離子源溫度230℃;四級桿溫度150℃;輔助通道溫度290℃;選擇離子監(jiān)測模式(SIM);TMT的定性離子為 165、183、185、187、200;CPZ 的定性離子為 58、86、233、272、318。TMT 的定量離子為185;CPZ的定量離子為318。

2.1.2 GC/MS法檢測尿樣中多氯聯(lián)苯的含量本研究參照Hong等人［2］報道的有關(guān) PCBs的檢測，氯聯(lián)苯主要代謝物為:2-羥基-2'，5，5'-三氯聯(lián)苯(2-OH-TrCB);4-羥基-2'，3，5，5'-四氯聯(lián)苯(4-OH-TeCB)和 4-羥基-2'，3，3'，4'，5'-五氯聯(lián)苯(4-OH-PeCB)。

2.1.3 GC/MS法檢測尿樣中 DBP的含量參照有關(guān)DBP氣質(zhì)聯(lián)用的檢測報道［3］，本研究確定了尿樣中DBP的檢測方法。

2.1.4 頂空氣相色譜法檢測尿液中甲醛、甲苯含量 甲酸為甲醛在人體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物。近年已有報道采用頂空氣相法單獨(dú)對甲醛代謝物［4］和甲苯［5］進(jìn)行了檢測。為簡化實(shí)驗(yàn)步驟，提高檢測效率，本研究采用頂空氣相法，通過對前處理?xiàng)l件及色譜條件的統(tǒng)一，同時分離測定了人尿中甲苯和甲醛代謝物，靈敏度高，分析時間短且預(yù)處理簡單。樣品預(yù)處理:取尿液2 ml于20 ml頂空瓶中，加1 g釋放劑硫酸銨至飽和，加入濃硫酸1 ml和乙醇0.1 ml，封閉后頂空氣相自動進(jìn)樣分析。色譜條件:色譜柱為HP-5(30 m ×0.32 mm ×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱，F(xiàn)ID檢測器，載氣為高純氮?dú)?，柱流? ml/min;柱溫40℃，氣化室溫度150℃，檢測器溫度300℃;氫氣流速30 ml/min，空氣流速400 ml/min，尾吹氣(氮?dú)?流速25 ml/min;分流進(jìn)樣，分流比:10/1;頂空加熱溫度70℃，加熱平衡時間45 min，進(jìn)樣環(huán)溫度80℃，傳送帶溫度90℃;進(jìn)樣體積為頂空瓶上部氣體1 ml，自動頂空進(jìn)樣。

2.1.5 GC法檢測尿樣中有機(jī)磷代謝產(chǎn)物的含量 參照有關(guān)有機(jī)磷的檢測報道［6］，本研究確定了尿樣中有機(jī)磷的檢測方法。

2.2 HPLC法檢測尿樣中二惡英代謝產(chǎn)物4，5-DCC的含量 KUMAGAI等人［7］報道指出二惡英代謝產(chǎn)物為4，5-DCC，參照其報道的方法，本研究采用了HPLC方法對尿樣中二惡英代謝產(chǎn)物4，5-DCC進(jìn)行了測定。

2.3 ELISA法檢測尿樣中AFM1的含量 樣品預(yù)處理:將尿樣用PBS稀釋6倍，調(diào)整pH為6.5～7.5，4000 g離心5 min后，取上清待用。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 三甲基氯化錫、鹽酸氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限 TMT在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=12457 C+2410 .8(R2=0.9919，P ＜0.0001)，線性范圍為0.05 ～5μg/ml，定量下限為 0.05 μg/ml。CPZ在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 A=475160 C+9527 .4(R2=0.9983，P ＜0.0001)，線性范圍為0.01～1 μg/ml，定量下限為0.01 μg/ml。

3.2 多氯聯(lián)苯標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限 2-OH-TrCB在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=116.4C+140(R2=0.9993，P ＜0.0001)，線性范圍為0.02～5.0 ng/ml，定量下限為 0.02 ng/ml。4-OH-TeCB在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=289C+1791 (R2=0.9991，P ＜0.0001)，線性范圍為0.02～5.0 ng/ml，定量下限為0.02 ng/ml。4-OH-PeCB在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=121.5C+198(R2=0.9993，P ＜0.0001)，線性范圍為0.02～5.0 ng/ml，定量下限為0.02 ng/ml。

3.3 鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限D(zhuǎn)BP在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=418.4C+5723 (R2=0.9942，P ＜0.0001)，線性范圍為2.0 ～80 ng/ml，定量下限為 2.0 ng/ml。

3.4 二惡英標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限 4，5-DCC在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=8.514C－1.758(R2=0.9992，P ＜0.0001)，線性范圍為 1.0～20.0 μg/ml，定量下限為 1.0 μg/ml。

3.5 甲醛和甲苯標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限 甲醛在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=102.87C－637.83(R2=0.9958，P ＜0.0001)，線性范圍為6.25 ～100 μg/ml，定量下限為 6.25 μg/ml。甲苯在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=20.58C+0.9928(R2=0.9934，P ＜0.0001)，線性范圍為0.16 ～3.22 μg/ml，定量下限為 0.16 μg/ml。

3.6 鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限D(zhuǎn)BP在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=418.4C+5723 (R2=0.9942，P ＜0.0001)，線性范圍為2.0 ～80 ng/ml，定量下限為2.0 ng/ml。

3.7 有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限 DMP在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.271C－0.023(R2=0.9915，P ＜0.0001)，線性范圍為 0.01～0.5 μg/ml，定量下限為 0.01 μg/ml;DEP 在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.716C－0.039(R2=0.9926，P ＜0.0001)，線性范圍為 0.01～0.5 μg/ml，定量下限為 0.01 μg/ml;DETP 在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.574C－0.0005(R2=0.9985)，線性范圍為 0.01 ～ 0.5 μg/ml，定量下限為0.01 μg/ml;DEDTP在空白尿樣中的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.430C－0.002(R2=0.9975，P＜0.0001)，線性范圍為 0.01 ～0.5 μg/ml，定量下限為 0.01 μg/ml。

3.8 黃曲霉素M1的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限AFM1標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=－0.4691x+1.3069(R2=0.9966)，線性范圍為100～2000 ng/L(圖1)，定量下限為100 ng/L。

圖1 黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Calibration curve of aflatoxin M1

3.9 環(huán)境污染物質(zhì)在人群中的分布 本研究對幾種常見環(huán)境污染物質(zhì)在體檢人群中暴露水平進(jìn)行了測定，并且分別對各污染物質(zhì)的檢出濃度及檢出人數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果見表1。

4 討論

本研究中所涉及到的污染物質(zhì)都是人們?nèi)粘Ｉ钪锌赡芙佑|得比較多的物質(zhì)，從結(jié)果中可看出，這幾類環(huán)境污染物質(zhì)在人體內(nèi)或多或少都能檢測到。甲苯的檢出率為33%;四種有機(jī)磷中，硫代磷酸二乙酯和二硫代磷酸二乙酯的檢出率分別為21.1%和41.2%，而在本次實(shí)驗(yàn)的80例體檢樣本中，磷酸二甲酯只檢測到2例，磷酸二乙酯只檢測到1例，這些污染物質(zhì)均可導(dǎo)致各種疾病甚至癌癥的發(fā)生;多氯聯(lián)苯和二惡英的檢出率比較低，2-羥基-2'，5，5'-三氯聯(lián)苯和 4-羥基-2'，3，5，5'-四氯聯(lián)苯檢測到 4 例陽性樣本，4-羥基-2'，3，3'，4'，5'-五氯聯(lián)苯、二惡英代謝產(chǎn)物4，5-二氯兒茶酚以及鹽酸氯丙嗪在80例樣本中均只檢測到1例，且檢測到的含量較低，而三甲基氯化錫在本次試驗(yàn)中沒有被檢出;甲醛代謝產(chǎn)物甲酸的檢出人數(shù)為78例，檢出率雖然高達(dá)97.6%，但人體正常代謝也能產(chǎn)生甲酸，有文獻(xiàn)報道人尿甲酸正常值范圍為 6.69 ～39.40 μg/ml［8］。本研究檢出的甲酸平均濃度為 8.07 μg/ml，最高濃度為 11.08 μg/ml，在正常值范圍內(nèi);黃曲霉素M1的檢出人數(shù)為73例，檢出率達(dá)到了91.4%。黃曲霉素M1是黃曲霉素的主要代謝物之一，是一類毒性和致癌性很強(qiáng)的化合物，與肝癌的發(fā)生有密切的關(guān)系［9］，其來源主要是人們對一些發(fā)霉的瓜果蔬菜食品的不注意以及對各種谷物和豆類儲存不當(dāng)所致。本課題組還對其他環(huán)境污染物質(zhì)的人群暴露水平進(jìn)行了測定［10-11］，這些物質(zhì)包括苯乙醛酸、苯乙醇酸、可的寧、雙酚A、乙烯雌酚和沙丁胺醇等，它們同樣具有慢性毒性，可不同程度地導(dǎo)致各種疾病的產(chǎn)生［12］。

表1 環(huán)境污染物內(nèi)暴露檢測結(jié)果Table 1 Results of internal exposure level of environmental pollutants (n=80)

環(huán)境污染物對人類健康的潛在威脅不容忽視，一方面，人們應(yīng)該了解自己體內(nèi)環(huán)境污染物質(zhì)的暴露水平，養(yǎng)成良好的飲食習(xí)慣和生活習(xí)性，盡量減少接觸那些暴露水平較高的物質(zhì);另一方面，需要研究這些環(huán)境污染物質(zhì)對人體的影響，建立安全限值。由于目前存在通量低、成本高等檢測技術(shù)瓶頸［1］，使得綜合評價環(huán)境污染物對人體健康影響的研究嚴(yán)重滯后。若能建立一種高通量初篩技術(shù)，篩出陽性樣本，再結(jié)合GC-MS和HPLC等方法定量檢測陽性樣本的集成檢測技術(shù)體系，有可能為這個領(lǐng)域的發(fā)展帶來希望。

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