張素華，呂曉燕，王奇

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西府海棠花粉生活力最佳培養(yǎng)基的研究

張素華，呂曉燕，王奇

（漯河市園林管理處，河南 462000）

在離體培養(yǎng)條件下，利用正交試驗設(shè)計，對西府海棠花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基進行了選擇，通過方差分析和多重比較，試驗結(jié)果表明：西府海棠花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基配方是蔗糖15mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+鈣離子1×10-6mg·L-1。

西府海棠；花粉活力；離體萌發(fā)；最佳培養(yǎng)基

花粉是種子植物特有的結(jié)構(gòu)，相當(dāng)于一個小孢子和由它發(fā)育的前期雄配子體。根據(jù)花粉形狀大小，對稱性和極性，萌發(fā)孔的數(shù)目等，可以鑒定到科和屬，甚至可以鑒定到植物的種[1]。它包含該物種的所有基因類型，具有豐富的遺傳多樣性，是種質(zhì)保存和交換以及雜交育種的重要材料[2]。

花粉生活力測定可采用花粉染色測定法、花粉授粉結(jié)實檢測法和花粉離體萌發(fā)測定法等[3]?；ǚ垭x體萌發(fā)一般在培養(yǎng)基上進行，常用的培養(yǎng)基基本成分是蔗糖和硼酸。其濃度一般為蔗糖10%~20%，硼酸0.001%~0.005%，pH 5.8~6.5，蔗糖的作用是提供合適的滲透壓和花粉管所需能量，硼酸中的硼元素為微量元素，能促進花粉管的萌發(fā)。不同植物花粉萌發(fā)所需的培養(yǎng)基種類和濃度不同，二細(xì)胞型花粉較易萌發(fā)，一般在培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可，而三細(xì)胞型花粉如菊花、水稻、甘藍(lán)等較難萌發(fā)，要在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加其他促進花粉萌發(fā)的因素，如Ca（NO3）2，MgSO4，PEG1261等。鈣是花粉萌發(fā)所必需的，并對花粉管生長具調(diào)節(jié)作用，硼是調(diào)節(jié)花粉管生長的重要微量元素，與鈣的作用密切相關(guān)。

1 本研究的目的和意義

西府海棠是山荊子（）和海棠花（）的雜交種，其樹形峭立，花大，芽艷，具有較高的觀賞價值，在園林中應(yīng)用歷史悠久，應(yīng)用范圍廣泛[4]。西府海棠資源豐富，花量大，便于大量采集。海棠的花粉可用于任何蘋果品種的人工授粉，效果與蘋果混合花粉效果相當(dāng)，而且海棠開花較蘋果早，采粉主動，因此在花粉資源不足的情況下，可采集海棠的花粉來進行人工授粉。本研究主要針對觀賞價值較高的西府海棠品種，利用懸液萌發(fā)的方法，研究花粉生活力同糖濃度、硼酸濃度、鈣離子濃度的關(guān)系，以“斜枝”西府海棠花粉為材料，篩選西府海棠花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

本試驗所用花粉材料均來自植物園內(nèi)生長健壯的西府海棠植株。摘取西府海棠含苞待放的花蕾，將花蕾用保鮮袋包好帶回，用鑷子取出花藥放入培養(yǎng)皿中，蓋上濾紙后置于陰暗處陰干花藥，當(dāng)花藥自然裂開，花粉自然散出后將其混勻，將花粉收集后分成16等份放入已在高溫高壓下滅菌的指形管內(nèi)備用。

2.2 實驗方法

2.2.1試驗儀器和試劑

試驗儀器：顯微鏡、移液槍、滴管、培養(yǎng)皿、指形管、試管等。

試驗試劑：蔗糖、氯化鈣、硼酸等。

2.2.2試驗設(shè)計

培養(yǎng)基選擇以“斜枝”西府海棠的花粉為材料，采用3因素4水平的正交試驗設(shè)計，所選擇的因素水平見表1，所選擇的正交見表2。每處理重復(fù)3次。

表1 培養(yǎng)基因素水平

表2 正交設(shè)計L16（43）

注：A-蔗糖濃度（mg·L-1）；B-硼酸濃度（mg·L-1）；C-氯化鈣濃度（mg·L-1）

2.2.3花粉萌發(fā)方法

花粉離體萌發(fā)采用懸液萌發(fā)法。把培養(yǎng)基滴在凹玻片的凹槽內(nèi)，每個凹玻片內(nèi)所滴的培養(yǎng)基的量都是相同的，用發(fā)絲蘸取少量花粉輕輕彈入培養(yǎng)基表面，將發(fā)絲和鑷子用酒精消毒滅菌，防止其他花粉的介入影響試驗結(jié)果。再用發(fā)絲和鑷子蘸取其他品種的花粉，播完花粉后貼上標(biāo)簽并標(biāo)記培養(yǎng)基配方號，記錄花粉接種的時間。將播有花粉的凹玻片放于有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25℃人工光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 h后在10×10倍顯微鏡下觀察各處理的花粉萌發(fā)率情況（以花粉管的長度大于花粉粒的直徑作為萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)[5]），隔3 h觀察1次，直至其萌發(fā)率不再有顯著增長為止。每次每個處理3次重復(fù)。記錄每個視野的花粉總數(shù)和萌發(fā)數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 西府海棠的最佳培養(yǎng)基選擇

在培養(yǎng)3 h、6 h、9 h時，觀察“斜枝”西府海棠花粉萌發(fā)情況，每個處理都可使花粉萌發(fā)。3 h后觀察的結(jié)果顯示，16個處理的花粉萌發(fā)率增長幅度差異較大，但是處理10的花粉萌發(fā)率是最高的，其次是處理5和處理12的花粉萌發(fā)率；隨著時間的延長每個處理的花粉萌發(fā)率都在增長，在培養(yǎng)6 h時，觀察的結(jié)果表明，處理5、處理9、處理10、處理11、處理12和處理15的花粉萌發(fā)率增長速度開始有所降低，但其他處理的花粉萌發(fā)率還在繼續(xù)增長；培養(yǎng)9 h時的觀察結(jié)果顯示，處理10的花粉萌發(fā)率最高，達到32.58%，其他處理的花粉萌發(fā)率幾乎達到最高，不再有顯著地增長，而在培養(yǎng)過程中，處理10的花粉萌發(fā)率一直是最高的。為分析每種因素及水平對西府海棠花粉萌發(fā)的影響，對蔗糖濃度、硼酸濃度及氯化鈣濃度3因素分別進行了方差分析和多重比較，比較結(jié)果見表3至表5。

表3 “斜枝”西府海棠主效應(yīng)多重比較

由表3的數(shù)據(jù)可以分析得出，蔗糖濃度為15 mg·L-1時，花粉萌發(fā)率最高，其萌發(fā)率平均值為30.10％，極顯著高于蔗糖濃度為10 mg·L-1和蔗糖濃度為20 mg·L-1的花粉萌發(fā)率；蔗糖濃度為5 mg·L-1的花粉萌發(fā)率顯著高于蔗糖濃度為10 mg·L-1的萌發(fā)率，極顯著高于蔗糖濃度為20 mg·L-1的萌發(fā)率，但與蔗糖濃度為15 mg·L-1的萌發(fā)率差異不顯著。因此，“斜枝”西府海棠花粉萌發(fā)最適合的蔗糖培養(yǎng)基濃度為15 mg·L-1和5 mg·L-1。

表4 “斜枝”西府海棠主效應(yīng)多重比較

由表4的數(shù)據(jù)可以分析得出，“斜枝”西府海棠的花粉在不同硼酸濃度條件下，雖然在硼酸濃度為1.5 mg·L-1時，其萌發(fā)率最高，為28.00%，但各硼酸濃度之間差異不顯著，這說明本試驗所設(shè)計范圍內(nèi)的各硼酸濃度對西府海棠花粉萌發(fā)的效果是一致的。

由表5的數(shù)據(jù)可以分析得出，氯化鈣濃度對西府海棠花粉萌發(fā)的影響在0.01水平上差異不顯著。在0.05水平上，以氯化鈣濃度1×10-6mg·L-1和 1×10-3mg·L-1時花粉萌發(fā)率最高，平均為27.9%和27.6%。氯化鈣濃度為1×10-6mg·L-1和1×10-3mg·L-1時，花粉萌發(fā)率顯著高于氯化鈣濃度為 1×10-5mg·L-1的萌發(fā)率，但和1×10-4mg·L-1的萌發(fā)率差異不顯著。當(dāng)氯化鈣濃度為1×10-3mg·L-1時，花粉的萌發(fā)率最低，平均為24.70%。由此可以得出在一定范圍內(nèi)，氯化鈣濃度對西府海棠花粉萌發(fā)的影響也不是特別顯著，當(dāng)氯化鈣濃度為1×10-6mg·L-1和1×10-3mg·L-1時，較適合西府海棠花粉萌發(fā)。

表5 “斜枝”西府海棠主效應(yīng)多重比較

在選擇西府海棠花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基時，依照以上各單因素的分析結(jié)果，最適合的蔗糖培養(yǎng)基濃度為15 mg·L-1和5 mg·L-1，最適合的氯化鈣濃度為1×10-6mg·L-1和1×10-3mg·L-1，4個濃度的硼酸效果一致，因此最終的最佳組合數(shù)為 2×2×4個，組合數(shù)較多；又因為這樣的單因素分析沒有考慮各因素之間是否存在互作，為了能夠篩選出適合西府海棠花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，在明確各單因素對西府海棠花粉萌發(fā)影響的前提下，對正交試驗中的所有16個組合的花粉萌發(fā)結(jié)果進行了方差分析和多重比較。在所觀察的時間內(nèi)9 h后各個處理的花粉萌發(fā)率不再有顯著增長，在9 h時幾乎達到最高，因此以9 h時各個處理的花粉萌發(fā)率來進行方差分析和多重比較。方差分析的結(jié)果表明蔗糖濃度、硼酸濃度和氯化鈣濃度3因素存在互作，進一步的多重比較結(jié)果見表6。

表6 “斜枝”西府海棠最佳培養(yǎng)基選擇多重比較

注：小寫字母表示差異顯著（a=0.05），大寫表示差異極顯著（a=0.01）

由表6可以看出，處理10的花粉萌發(fā)率最高，為32.58%，顯著高于處理1、5和9，極顯著高于處理7、8、13、14、15和16，但是和處理2、3、4、6、11和12之間沒有顯著差異；其次是處理12的花粉萌發(fā)率為31.60%，顯著高于處理7和9，極顯著高于處理8、13、14、15和16。處理12與其余的處理均差異不顯著。處理3和處理6的花粉萌發(fā)率均在30%以上，顯著高于處理7，極顯著高于處理8、13、14、15和16。雖然處理2、3、4、6、10、11和12同屬于一個水平，但是處理10的花粉萌發(fā)率最高，且顯著高于處理1、5和9。處理12的花粉萌發(fā)率次之，且與處理1、5和9差異不顯著，經(jīng)過方差分析和多重比較可知處理10為最佳培養(yǎng)基，即蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+鈣離子1×10-6mg·L-1。

考慮互作后選擇出的最佳培養(yǎng)基是處理10，即蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+鈣離子1×10-6mg·L-1。在單因素比較分析時，蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+鈣離子1×10-6mg·L-1也是最佳培養(yǎng)基組合之一，二者的分析結(jié)果是一致的。因此，確定離體培養(yǎng)“斜枝”西府海棠花粉的最佳培養(yǎng)條件為蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+鈣離子 1×10-6mg·L-1。

4 結(jié)論

通過對西府海棠花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基的選擇，得出以下結(jié)論：西府海棠花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為蔗糖15 mg·L-1+硼酸1.5 mg·L-1+鈣離子1×10-6mg·L-1。本試驗花粉的萌發(fā)率是在離體培養(yǎng)條件下獲得的，其高低并不完全等同于實際授粉萌發(fā)率，因為在自然條件下花粉的萌發(fā)率會受更多因素的影響。

[1] 李育農(nóng). 蘋果屬植物種植資源研究[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè) 出版社，2001.

[2] 郭 翎，沈向，余樹勛，等. 觀賞海棠育種現(xiàn)狀與育種方向[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002（增刊），30-32.

[3] 胡適宜. 植物學(xué)實驗方法—花粉生活力的測定[J]. 植物學(xué)通報，1993，10（2）：60-62.

[4] 劉武林. 花粉的采集、貯藏和生活力檢驗[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，1981，6（3）：87-94.

[5] 王欽麗，盧龍斗，吳小琴，等. 花粉的保存及其生活力測定[J]. 植物學(xué)通報，2002，19（3）：365-373.

2013-02-15

S 661.4

A

1003-2630（2013）03-0005-03

（責(zé)任編輯：王團榮）