金 宏 齊 玲 劉 威 袁 瑞 溫 娜 于洪泉 (吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 3203)

五味子是一種較常見的普通中藥材，屬木蘭科多年生落葉，木質(zhì)藤本植物，五味子作為藥材，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品?，F(xiàn)代藥理研究表明，五味子含有多種營養(yǎng)成分，如五味子素、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、脂肪油、揮發(fā)油、糖類、樹脂、維生素C等，還含有鎢、鐵、錳、鋅、磷等微量元素，是非常有益的健康食品及藥物，常用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病的治療。本研究探討五味子木脂素對體外培養(yǎng)的腦神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用及對大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、RPMI1640、二甲基亞砜(DMSO)(Thermo公司)，小牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司)，五味子木脂素(北華大學(xué)提供)，四甲基偶氮唑(MTT)(Sigma公司)。

1.2 小鼠原代神經(jīng)細(xì)胞的提取〔1〕取1月齡小鼠，將其斷頸處死，75%酒精消毒，剪斷頸部取出腦組織，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，用組織剪將腦組織剪成1 mm×1 mm大小，置于15 ml離心管中，加入胰蛋白酶，37℃水浴消化30 min，加小牛血清終止消化，離心，棄上清，加培養(yǎng)液反復(fù)吹打，70 nm濾膜過濾，離心，棄上清，加含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，接種于25 mm培養(yǎng)瓶中，每天觀察生長情況。

1.3 大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，迅速放入37℃水浴箱中復(fù)蘇，然后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含10%小牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

1.4 藥物作用細(xì)胞生長情況 取等量五味子木脂素分別加入含5%小牛血清的DMEM和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，配制成終濃度為0、50、100、200μg/ml的藥物。取對數(shù)生長期的神經(jīng)細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，用胰酶消化后，分別加入相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為8×103/ml。將細(xì)胞懸液分別均勻接種于96孔板中，每孔100μl，置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步。棄去上清液，加入含不同濃度的五味子木脂素，每個藥物濃度重復(fù)3次，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。藥物作用結(jié)束時，每孔加入MTT 20μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止細(xì)胞培養(yǎng)，棄去上清液，每孔分別加DMSO 150μl，震蕩均勻使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，用不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD、DUNCAN法和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

藥物作用48 h，隨藥物濃度的增加對神經(jīng)細(xì)胞生長無明顯抑制作用，細(xì)胞在50μg/ml和100μg/ml時仍保持增殖趨勢，說明該藥在200μg/ml濃度內(nèi)對細(xì)胞無明顯毒副作用。藥物作用膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度增加，對細(xì)胞開始呈現(xiàn)明顯的抑制作用，尤其是藥物濃度超過100μg/ml時，抑制作用尤為明顯(P＜0.01)，說明該藥對膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明顯抑制作用，并且與藥物濃度呈正相關(guān)。見表1。

表1 五味子木脂素對神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用(x ± s，n=3)

3 討論

近些年來，尋找低毒高效的抗腫瘤藥物成為研究的熱點(diǎn)問題之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五味子木脂素濃度在200μg/ml以內(nèi)對正常腦神經(jīng)細(xì)胞無明顯毒副作用，藥物作用后細(xì)胞仍保持增殖能力，藥物不抑制正常神經(jīng)細(xì)胞的生長。這一結(jié)論在國內(nèi)外鮮有報道〔2〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了中藥五味子具有毒性小的特點(diǎn)。

五味子木脂素體外抑瘤實(shí)驗(yàn)表明，藥物濃度在200μg/ml以內(nèi)隨藥物濃度的增加對腫瘤細(xì)胞的抑制率增強(qiáng)，說明該藥對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，這一結(jié)論與本課題組之前的研究結(jié)果一致。同時也與一些學(xué)者〔3～5〕研究結(jié)論相似。迄今為止，研究表明五味子木脂素抑制腫瘤的具體途徑有很多種，如發(fā)揮其抗氧化作用抗腫瘤〔6〕，通過多種方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡〔7〕，抑制腫瘤內(nèi)血管的生成而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤目的〔8〕，通過抑制癌基因起到抗腫瘤作用〔9〕，作為分子靶向藥物的新靶點(diǎn)起到抗腫瘤作用〔10〕等，那么五味子對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞是通過什么方式來發(fā)揮其抑瘤作用，目前還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

1 Galli R，Gritti A，Vescovi AL.Adult neural stem cells〔J〕.Met Mol Biol，2008;438:67-84.

2 苗明三.五味子多糖對衰老模型小鼠的影響〔J〕.中國醫(yī)藥學(xué)報，2002;17(3):187-8.

3 顧 穎，李 凌.五昧子乙素促進(jìn)多柔比星誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC7721凋亡的研究〔J〕.實(shí)用腫瘤雜志，2006;2(5):412-6.

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5 呂冬霞，崔 健，劉月霞，等.五味子乙素聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)H22肝癌移植瘤細(xì)胞凋亡過程中caspase-3，8，9表達(dá)的研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009;29(4):416-8.

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7 劉曉霓，金秀東，張承玉，等.復(fù)方五味子素B抑制人胃癌細(xì)胞株增殖的機(jī)制研究〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2008;19(4):262-5.

8 遲德彪.五味子乙素對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響〔D〕.廣州:南方醫(yī)科大學(xué)博士論文，2008:4.

9 李先偉，楊解人.五味子乙素抗H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的機(jī)制〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;31(12):2244-7.

10 牟遇霖.五味子抗腫瘤的研究現(xiàn)狀〔J〕.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010;7(2):84-5.