王立波 莽 靖 劉曉陽(yáng) 王曉明 何金婷 包曉群 徐忠信

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130033)

慢性腦缺血是臨床上常見的腦損傷之一，是阿爾茨海默病、血管性癡呆和Binswanger病等多種疾病發(fā)展過程中的一個(gè)共同病理過程，其損傷機(jī)制尚不完全清楚。本研究前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，Rho激酶(ROCK)2參與慢性缺血性腦損傷過程〔1〕，但其下游作用底物肌球蛋白結(jié)合亞單位(MBS)在慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙中的變化及相關(guān)干預(yù)對(duì)其的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)在成功制備慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙模型基礎(chǔ)上，以ROCK為靶點(diǎn)，探討ROCK2/MBS信號(hào)傳導(dǎo)參與慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙損傷的機(jī)制，為慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性Wistar大鼠54只，體重320～340 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，經(jīng)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選后，隨即平均分為:假手術(shù)組、缺血(2VO)組和ROCK抑制劑(法舒地爾)組，每組再根據(jù)缺血時(shí)間隨機(jī)分為3、6、9 w三組，每組6只。

1.2 模型建立及給藥方法 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性阻斷法(2VO)建立慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?〕。ROCK抑制劑(法舒地爾)組于術(shù)后48 h內(nèi)，每天予鹽酸法舒地爾注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))7.5 mg/kg腹腔注射。各模型組于雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后3、6、9 w，再次麻醉大鼠，斷頭取腦，分離皮層，液氮保存。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 以Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮由圓形水池、自動(dòng)攝像機(jī)及電腦分析系統(tǒng)組成。記錄大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期，escape lantency)和游泳路徑。如大鼠在120 s內(nèi)未找到站臺(tái)者，潛伏期記為120 s。選取搜索持續(xù)時(shí)間(逃避潛伏期)和搜索行走路徑(游泳距離)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。術(shù)后大鼠找到平臺(tái)所用時(shí)間越長(zhǎng)，在此期間走的距離越長(zhǎng)，表明其學(xué)習(xí)記憶保持能力越差，提示學(xué)習(xí)記憶受損嚴(yán)重。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。

1.4 RT-PCR檢測(cè)ROCK2 mRNA表達(dá) 大鼠額葉皮層組織經(jīng)Trizol法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)ROCK2 mRNA的表達(dá)。反應(yīng)條件為 94℃ 預(yù)變性5 min，94℃ 變性30 s，47℃退火 40 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果、照相，用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描后，Bandscan軟件分析條帶灰度，分別計(jì)算ROCK2條帶的光密度與相對(duì)的β-actin條帶光密度的比值，表示各組mRNA表達(dá)水平。引物根據(jù)GenBank檢索的核苷酸序列用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。見表1。

表1 引物序列和PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.5 Western印跡檢測(cè)ROCK2、MBS蛋白表達(dá) 分離提取各時(shí)間點(diǎn)腦組織皮層細(xì)胞，PBS洗滌2次，每次1 000 r/min，離心5 min;將細(xì)胞沉淀溶于150μl細(xì)胞裂解液，4℃裂解 30 min;4℃12 000 r/min離心2 min，收集上清即為總蛋白粗提液。應(yīng)用Bio-rad測(cè)定蛋白含量。12%SDS-PAGE電泳(恒壓100 V，3 h)，電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h。使用5%脫脂牛奶按比例適當(dāng)稀釋一抗，然后一抗孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜，加入HRP二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌膜，ECL顯色液曝光。結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描后，Bandscan分析條帶灰度，分別計(jì)算ROCK2、MBS條帶的光密度與相對(duì)的β-actin條帶光密度的比值，表示各組蛋白表達(dá)水平。一抗為兔抗鼠ROCK2、MBS(武漢博士德生物制品公司)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠不同缺血時(shí)間學(xué)習(xí)記憶能力變化 假手術(shù)組3、6、9 w大鼠搜索持續(xù)時(shí)間(逃避潛伏期)和搜索行走路徑(游泳距離)無(wú)明顯變化(P＞0.05)，缺血3 w時(shí)，大鼠逃避潛伏期和游泳距離明顯延長(zhǎng)，與假手術(shù)組相比差異顯著(P＜0.05)，缺血6 w和9 w時(shí)，與假手術(shù)組相比也有顯著差異(P＜0.05)，9 w時(shí)，大鼠逃避潛伏期和游泳距離改變最為顯著，與3 w相比有顯著差異(P＜0.05)。表明隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。法舒地爾組各時(shí)間點(diǎn)學(xué)習(xí)記憶成績(jī)均較缺血組明顯提高(P＜0.05)，但仍未恢復(fù)正常水平。見表2、表3。

表2 各組大鼠不同缺血時(shí)間逃避潛伏期(n=6，±s)

表2 各組大鼠不同缺血時(shí)間逃避潛伏期(n=6，±s)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與缺血組比較:2)P＜0.05;下表同

13.29±4.76 14.02±3.86 15.45±4.06缺血組 29.16±6.431) 32.24±5.121) 36.65±7.851)法舒地爾組 19.18±3.051)2) 21.54±2.481)2) 23.76±2.971)2)3 w 6 w 9 w假手術(shù)組組別

表3 各組大鼠不同缺血時(shí)間游泳距離(n=6，cm)

圖1 不同缺血時(shí)間ROCK2蛋白及mRNA表達(dá)

2.2 大鼠不同缺血時(shí)間皮層ROCK2蛋白及mRNA表達(dá) 見圖1。假手術(shù)組有弱ROCK2蛋白和mRNA表達(dá)，缺血3 w后ROCK2蛋白和mRNA表達(dá)增加，均高于假手術(shù)組(P＜0.05)，且隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，6 w時(shí)出現(xiàn)表達(dá)高峰，9 w時(shí)表達(dá)有所下降，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05);法舒地爾干預(yù)后，大鼠額葉皮層ROCK2蛋白和mRNA表達(dá)均低于同一時(shí)間點(diǎn)缺血組(P＜0.05)，但仍高于相同時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組(P＜0.05)。

2.3 大鼠不同缺血時(shí)間額葉皮層腦組織MBS蛋白表達(dá)MBS蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，缺血組和法舒地爾組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MBS蛋白表達(dá)均增高(P＜0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，MBS蛋白表達(dá)增高，6 w時(shí)達(dá)最高峰，與ROCK表達(dá)一致;法舒地爾干預(yù)后，大鼠額葉皮層MBS蛋白表達(dá)均低于同一時(shí)間點(diǎn)的鹽水缺組組(P＜0.05)，但仍高于相同時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組(P＜0.05)。見圖2。

圖2 不同缺血時(shí)間MBS蛋白表達(dá)

3 討論

慢性腦缺血是臨床上常見的腦損傷之一，目前非常重視對(duì)慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙防治的研究。有研究表明，在腦組織低灌注和低代謝狀態(tài)下，大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能可發(fā)生減退〔3〕。本研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血可使大鼠逃避潛伏期和游泳路徑均明顯延長(zhǎng)，大鼠學(xué)習(xí)記憶功能發(fā)生改變，并隨著時(shí)間推移逐漸加重，表明大鼠慢性腦缺血可以導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。研究結(jié)果與Rho激酶可以通過多種途徑影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，參與血管損傷后內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖以及再狹窄的調(diào)控過程相一致〔4〕。

Rho是哺乳類動(dòng)物Ras基因超家族的一個(gè)亞群，被稱為小GTP結(jié)合蛋白(小G蛋白)。Rho的下游效應(yīng)器為Rho激酶(ROCK)，是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，它有兩種細(xì)胞亞型，分別是ROCK 1和ROCK 2，ROCK-1在除腦和肌肉外的其他組織中普遍表達(dá)，而ROCK2廣泛表達(dá)于腦、肌肉、心肺和胎盤。ROCK的主要作用底物是肌球蛋白輕鏈脫磷酸化酶(MLCP)的肌球蛋白結(jié)合亞基(MBS)，ROCK的激活本身可以將MLC磷酸化而發(fā)生肌絲收縮作用，同時(shí)也能將MLCP磷酸化，從而使MLCP失活，阻止了磷酸化的MLC脫磷酸失活，間接促進(jìn)MLC磷酸化而促進(jìn)平滑肌收縮〔5〕。Rho和ROCK活性在腦血管疾病中普遍地增加，不僅僅在血管平滑肌，而且在內(nèi)皮，甚至在炎癥細(xì)胞和神經(jīng)元。ROCK不僅僅參與平滑肌細(xì)胞的收縮，還可能通過與ATⅡ、ET21、PDGF等血管活性物質(zhì)的相互作用參與許多細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和缺血性腦損害等血管性疾病的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切〔6～9〕。本研究結(jié)果表明慢性缺血后不但有ROCK的表達(dá)上調(diào)，并存在功能活化，與認(rèn)知功能改變平行。因此，ROCK的表達(dá)變化與慢性腦缺血認(rèn)知功能損傷密切相關(guān)。

血管平滑肌細(xì)胞的收縮取決于胞漿內(nèi)MLC磷酸化程度，慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙時(shí)血管段肌球蛋白輕鏈磷酸化水平升高。肌球蛋白輕鏈磷酸化水平主要由肌球蛋白輕鏈磷酸酶參與的鈣增敏途徑調(diào)節(jié)，而并非細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的增加〔10，11〕。本研究說明這兩組血管段的肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性下降，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈磷酸化水平升高。ROCK磷酸化肌球蛋白輕鏈結(jié)合亞基，使肌球蛋白輕鏈磷酸酶失活，提高了肌球蛋白輕鏈磷酸化水平，并增強(qiáng)了鈣增敏作用，使血管平滑肌收縮性增高，腦組織特別是額葉皮層血供發(fā)生障礙，導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。因此，ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過增加磷酸化肌球蛋白輕鏈結(jié)合亞基，抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性及加強(qiáng)鈣增敏途徑參與了慢性腦缺血致認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制。

自Rho蛋白的發(fā)現(xiàn)即開始研制ROCK抑制劑。作用機(jī)制主要為通過與ATP競(jìng)爭(zhēng)ROCK催化區(qū)的ATP結(jié)合位點(diǎn)而阻斷了ROCK的活性，具有較強(qiáng)的平滑肌松弛作用，對(duì)肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)具有抑制作用，從而使血管平滑肌舒張，擴(kuò)張血管，具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值〔12〕。本研究提示ROCK參與了慢性腦組織低灌注損傷過程，ROCK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化可能是慢性腦低灌注后認(rèn)知功能障礙機(jī)制之一。

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