盧鳳美 劉東璞 王明富 郭夢(mèng)凡 孟慶媛 盛延良 王 抒

(佳木斯大學(xué)司法鑒定中心，黑龍江 佳木斯 154007)

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化的中間環(huán)節(jié)，有效的控制肝纖維化進(jìn)展具有重要的臨床意義。實(shí)驗(yàn)證明紅景天具有保護(hù)肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種功效，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到其具有良好的干預(yù)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化作用。Smads是一族傳遞TGFβ信號(hào)的分子，其中Smad6，7具有抑制作用，Smad4則為傳遞信息必需的共用Smad分子，阻斷或干擾該上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有可能阻止肝纖維化進(jìn)程〔1〕，為肝纖維化的治療帶來了新希望。本文針對(duì)CCl4中毒性大鼠肝纖維化模型，應(yīng)用反義寡核苷酸技術(shù)及免疫組化技術(shù)，以 Smad4及Smad7為靶基因，觀察紅景天對(duì)Smad4及Smad7基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步從分子水平探討紅景天干預(yù)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，質(zhì)量180～220 g，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。四氯化碳(CCl4)購自天津石英釧廠霸州市化工廠分廠。紅景天膠囊購自福州恒豐量子生物科技有限公司。組織RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為立陶宛MBI公司產(chǎn)品。Smad4、Smad7上下游引物及兔抗大鼠Smad4、Smad7的一抗由上海生物工程公司生產(chǎn)。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的免疫組化通用型羊抗兔的二抗工作液由北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組 隨機(jī)分組:①正常組;②肝纖維化模型組;③復(fù)方紅景天治療組。每組20只，各組間暴露因素?zé)o差別(P＞0.05)。用CCl4腹腔注射法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，即用100 ml/L CCl4(橄欖油稀釋)1 ml/kg，1次/w，共8 w。紅景天干預(yù)組在造模的同時(shí)給予紅景天灌胃(濃度40 g/L，劑量10 ml/kg，2次/w，共8 w)，肝纖維化模型組造模同時(shí)予生理鹽水灌胃，正常組予等量橄欖油和生理鹽水灌胃處理。各組大鼠在最后一次CCl4注射后48 h處死，部分肝臟用4%甲醛固定，留做病理檢查，其余標(biāo)本迅速放到-80℃冰箱保存。

1.2.2 常規(guī)病理學(xué)檢查 病理學(xué)切片用HE染色，按2000年在西安會(huì)議上由中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的慢性肝炎分級(jí)分期標(biāo)準(zhǔn)判定肝纖維化程度。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)肝組織中Smad4 mRNA、Smad7 mRNA

TRIzol一步法提取組織總RNA，總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)。取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入25 g/L溴乙啶瓊脂糖凝膠中，以80 V/cm電壓電泳50 min，在紫外線下可見相應(yīng)的長(zhǎng)度的目的基因和內(nèi)參的擴(kuò)增條帶，將電泳結(jié)果直接置于凝膠分析系統(tǒng)中對(duì)條帶進(jìn)行分析。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Primer-3軟件設(shè)計(jì)目的基因的擴(kuò)增引物。Smad 4:上游:5'-TGCAGGTGGCTGGTCGGAAAG-3'，下游:5'-AGGATGATTGGAAATGGGAGGCTG-3'，長(zhǎng)度 710 bp，反應(yīng)條件分別是:94℃ 2 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，28個(gè)循環(huán)(經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件);72℃ 7 min。SMad7:上 游:5'-TCTCAGGCATTCCTCGGAAGTC-3'，下 游:5'-ACGCC ATCCACTTCCCTTGTC-3'，長(zhǎng) 度481 bp，反應(yīng)條件分別是:94℃ 2 min，94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃50 s，28個(gè)循環(huán)(經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)摸索最佳實(shí)驗(yàn)條件);72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用Bio-RadGel Doc2000型凝膠成像系統(tǒng)照像并用QuangtityOne軟件計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)值。

1.2.4 免疫組化檢測(cè)肝組織中Smad4、Smad7 用3'，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)二步法檢測(cè)肝組織中Smad4、Smad7。方法:石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水。用30 ml/L H2O2消除內(nèi)源性過氧化氫酶，以檸檬酸鹽工作緩沖液微波熱修復(fù)，用100 ml/L正常山羊血清封閉非特異性抗原，滴加1∶200的一抗，4℃孵育過夜。滴加適量的二抗(HRP標(biāo)記)工作液，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素液復(fù)染，封片。以磷酸鹽緩沖液代替第一抗體作陰性對(duì)照。對(duì)陽性染色采用HPIAS-2000型高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，按照Weidner方法，雙盲法閱片，先在低倍鏡下選擇陽性結(jié)果密集區(qū)域，然后在高倍視野下自動(dòng)計(jì)算A值，取平均值計(jì)為該切片的A值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝組織Smad4表達(dá) RT-PCR檢測(cè)正常肝組織未見明顯Smad4 mRNA陽性表達(dá)細(xì)胞;模型組大鼠肝組織Smad4 mRNA的水平較正常組顯著增高(P＜0.01);紅景天治療組大鼠肝組織中Smad4 mRNA的水平較模型組顯著降低(P＜0.05)。免疫組化染色可見正常大鼠肝組織未檢出明顯的Smad4表達(dá)，模型組大鼠肝組織則Smad4表達(dá)明顯增加，棕黃色陽性顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，陽性細(xì)胞集中于匯管區(qū)，以梭狀的間質(zhì)細(xì)胞為主，肝細(xì)胞未見明確陽性反應(yīng)。紅景天治療組大鼠肝組織Smad4表達(dá)較模型組明顯減少，陽性細(xì)胞亦主要位于匯管區(qū)，以間質(zhì)細(xì)胞為主。各組陰性對(duì)照未見陽性表達(dá)，證實(shí)免疫組化和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果具有特異性(P＜0.05)。見表 1，圖 1、圖 2。

圖1 肝組織中Smad4 mRNA表達(dá)的變化

圖2 肝組織中Smad4表達(dá)(×100)

表1 肝組織Smad4、Smad7表達(dá)的變化(x ± s，n=20)

2.2 大鼠肝組織Smad7表達(dá) RT-PCR檢測(cè)正常肝組織未見明顯Smad7 mRNA陽性表達(dá)細(xì)胞，紅景天干預(yù)性治療組大鼠肝組織Smad7 mRNA陽性率高于模型組(P＜0.01);免疫組化染色可見，正常大鼠肝組織未檢出Smad7表達(dá)，模型組大鼠肝組織只有少量細(xì)胞出現(xiàn)Smad7陽性表達(dá)，棕黃色陽性顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞主要位于匯管區(qū)，以梭狀的間質(zhì)細(xì)胞為主，肝細(xì)胞未見明確陽性反應(yīng)。紅景天干預(yù)性治療組大鼠肝組織Smad7蛋白陽性率高于模型組(P＜0.01)。見表1，圖3、圖4。

圖3 肝組織中Smad7 mRNA表達(dá)的變化

圖4 肝組織中Smad7表達(dá)(×100)

3 討論

治療肝纖維化的研究是國內(nèi)外的熱點(diǎn)課題。近年來分子生物學(xué)、分子病理學(xué)、分子藥理學(xué)等邊緣學(xué)科的快速發(fā)展使人們對(duì)肝纖維化發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深化。Smads蛋白家族是近年來發(fā)現(xiàn)的新的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。大量研究證實(shí)TGFβ-Smad信號(hào)通路是肝纖維化時(shí)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔2～4〕。根據(jù)Smads蛋白在TGF-β家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，將其分為3類:①受體激活型 Smads(R-Smads)，包括 Smad2、Smad3以及Smad1、Smad5、Smad8 和 Smad9，能被 TGF-βⅠ型受體(TβRI)激活并與受體形成短暫復(fù)合物〔5〕;②共同通路型 Smads(Co-Smad)，目前只有Smad4，主要通過與受體激活型Smads相連，從而參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔6〕;③抑制型Smads(I-Smads)，包括Smad6和Smad7，可與激活的Ⅰ型受體結(jié)合，抑制或調(diào)節(jié)TGF-β家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔7〕。TGF-β1是導(dǎo)致組織纖維化最重要的調(diào)節(jié)因子，與胞膜表面的TβRⅡ結(jié)合后，激活TβRⅠ，使Smad2、Smad3磷酸化而活化，繼而與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，將信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核〔8，9〕。Smad7則可抑制Smads復(fù)合物的形成或抑制Smad2、Smad3磷酸化而阻止該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

近年來，有關(guān)中草藥對(duì)肝纖維化的防治報(bào)道較多，但紅景天對(duì)肝纖維化TGFβ-Smad信號(hào)通路及Smads影響的研究報(bào)道甚少。本文應(yīng)用半定量RT-PCR與免疫組化的方法，分別從mRNA與蛋白表達(dá)水平觀察紅景天對(duì)纖維化肝組織中Smad4、Smad7表達(dá)的影響，結(jié)果顯示模型組中的Smad4蛋白表現(xiàn)為持續(xù)性高表達(dá)，且主要分布于非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，說明Smad4在纖維化肝臟主要來源于產(chǎn)生ECM的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞?？梢奡mad4表達(dá)增加及隨后導(dǎo)致的Smads復(fù)合物在非實(shí)質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的增加，最終誘導(dǎo)了非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的ECM合成基因的轉(zhuǎn)錄，表明Smad4過度表達(dá)是TGF-β或TβRⅠ持續(xù)激活，引起ECM大量堆積的主要原因〔10〕。在纖維化肝臟中，Smad4除了分布于非實(shí)質(zhì)細(xì)胞外，肝細(xì)胞中也有少量表達(dá)，可能是因?yàn)門GF-β在肝纖維化的發(fā)生中，除了通過刺激肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖、合成ECM，還可作用于肝細(xì)胞，抑制其再生，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡〔11〕，從而放大肝損傷形成惡性循環(huán)，使纖維化加重;紅景天可以較好防治CCl4損傷性肝纖維化，大鼠肝組織Smad4的表達(dá)減少，明顯低于模型組，高于正常對(duì)照組;模型組中Smad7表現(xiàn)為全程持續(xù)性低表達(dá)，未見到反應(yīng)性上調(diào)。用紅景天干預(yù)后大鼠肝組織Smad7的表達(dá)逐漸增多，明顯高于模型組，高于正常對(duì)照組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅景天通過抑制Smad4、促進(jìn)Smad7的表達(dá)，保護(hù)纖維化肝組織內(nèi)包括HSC在內(nèi)的細(xì)胞周圍正常的基底膜樣細(xì)胞間質(zhì)，抑制HSC的活化與肝纖維化的發(fā)展，從而有效地干預(yù)了TGFβ介導(dǎo)的肝纖維化信號(hào)傳導(dǎo)過程，可能是其抗肝纖維化分子機(jī)制之一。

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