高 雪 楊 鏞(昆明市第一人民醫(yī)院干療科，云南 昆明 650000)

缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α與同源盒(gax)基因是參與血管內(nèi)皮細胞(VEC)和血管平滑肌細胞(VSMC)增殖的主要相關(guān)基因〔1〕。VEC與VSMC連接結(jié)構(gòu)是二者之間相互傳遞信息的重要通路〔2〕。本研究探討 HIF-1α與gax基因表達水平對VECVSMC細胞連接生成的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 Wistar大鼠20只，雌雄不拘，體重(250±40)g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。隨機分為對照組和實驗組，每組10只。

1.2 動物模型制作及標本收集 兩組實驗動物均行自體靜脈移植術(shù)。10%水合氯醛腹腔麻醉，切取4 mm大鼠右頸內(nèi)靜脈，其中，實驗組切取下的靜脈置于高滴度的含有HIF-1αcDNA的重組腺伴隨病毒(rAAV)工作液中(rAVV-HIF-1α為2×1011v.g/ml)，0～4℃下體外孵育45 min;而對照組切取的靜脈僅用空載rAAV工作液處理，0～4℃下體外孵育45 min，兩組切取的靜脈均與對側(cè)頸總動脈端端吻合，術(shù)后分籠標記統(tǒng)一飼養(yǎng)。術(shù)后14 d時，在麻醉下切取大鼠移植靜脈。每組動物分別隨機選擇6只大鼠的移植血管，即刻置于液氮，于-70℃冰箱中保存，用于RT-PCR;4只大鼠移植血管置2.5%戊二醛中固定，4℃保存，用于電鏡觀察。

1.3 RT-PCR 總RNA提取(Trizole液，Sangon)，紫外分光光度計(A260/A280)檢測RNA純度。總RNA 1μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積20μl(美國Promega公司產(chǎn)品)，逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA于-20℃下保存。HIF-1α 引物設(shè)計參照文獻〔3〕，HIF-1α(568 bp，上海生物工程公司)上游引物5'-TGAGGCTCACCATCAGTTAT-3'，下游引物 5'-TAACCCCATGTATTTGTTC-3'，β-actin 為內(nèi)參照，上游引物 5'-ATTGTAACCAACTGGGACG-3'，下游引物5'-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3'，擴增產(chǎn)物640 bp。PCR擴增體系50 μl。擴增條件為 94℃ 2 min，1 個循環(huán);95℃ 15 s，55℃30 s，72℃ 30 s，28個循環(huán)，接 72℃后延伸 5 min。采用自動電泳凝膠成像分析儀(Chem Imager 5500，USA)及分子分析軟件進行圖像掃描和分析。HIF-1α積分灰度值/β-actin積分灰度值，所得值為HIF-1αmRNA相對表達值。gax引物由中國醫(yī)科大學(xué)分子遺傳學(xué)研究室設(shè)計，上游引物:5'-CCCGCGCGGCTTTTACATTAGGAGT-3'，下游引物:5'-GCTGGCAAACATGCCCTCCTCATTG-3'(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)，擴增產(chǎn)物片段為300 bp。

1.4 Western印跡檢測HIF-1α和gax蛋白表達 HIF-1α和gax單克隆抗體(BOSTER生物工程公司提供)。操作均按說明書進行。

1.5 透射電鏡觀察 移植靜脈5～6塊，每塊1.0 mm×1.0 mm×2.0 mm，2.5%戊二醛前固定，緩沖液漂洗，1%鋨酸后固定，30%、50%和70%酒精及80%、90%和100%丙酮逐級脫水，浸透包埋，聚合，修塊，LKB-V型超薄切片機制作超薄切片(50～70 nm/片)，以醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙重染法行電子染色，H-600型透射電鏡(HITACHI，Japan)觀察VSMC超微結(jié)構(gòu)。連續(xù)計數(shù) 200個 VSMC，其中合成型 VSMC與收縮型VSMC數(shù)量用百分比表示。

2 結(jié)果

2.1 二組HIF-1α和gax mRNA和蛋白表達水平 靜脈移植術(shù)后14 d，在568 bp處可見兩條HIF-1αmRNA的RT-PCR表達產(chǎn)物。實驗組HIF-1αmRNA表達明顯高于對照組(P均＜0.01)。見表 1，圖 1，圖 2。

2.2 兩組大鼠移植靜脈透射電鏡觀察結(jié)果 移植靜脈術(shù)后14 d，對照組中少見增生的VEC-VSMC細胞連接的超微結(jié)構(gòu)，VSMC排列欠規(guī)整。實驗組中VEC增生顯著，VSMC排列較規(guī)整，VEC-VSMC細胞連接重建顯著，中間型(又稱為過渡型)和收縮表型VSMC居多(P均＜0.01)。見表2，圖3。

表1 兩組HIF-1α和gax mRNA和蛋白表達水平(x ± s，n=6)

表2 移植靜脈VSMC增殖狀態(tài)檢測結(jié)果(x ± s，n=4)

圖1 兩組HIF-1α和gax mRNA RT-PCR表達產(chǎn)物

圖2 兩組HIF-1α、gax蛋白免疫印跡雜交結(jié)果

圖3 術(shù)后14 d實驗組移植靜脈超微結(jié)構(gòu)(×6 000)

3 討論

對血管組織中的VEC-VSMC細胞連接的認識大約經(jīng)歷了三個時期:二十世紀80年代中期提出肌內(nèi)皮連接結(jié)構(gòu)的概念;繼之于90年代中期證明VEC與VSMC之間通過各自胞漿突出延伸可形成一種可傳遞信息的連接結(jié)構(gòu);二十一世紀初期通過部分學(xué)者對這一連接結(jié)構(gòu)的諸多描述而逐漸將這一結(jié)構(gòu)定性和定量化。所謂VEC-VSMC細胞連接是指在顯微鏡下觀察到血管組織中VSMC與VEC之間有突起的胞漿，該VSMC胞漿穿過內(nèi)彈力板上的許多小孔到達VEC并與VEC胞漿結(jié)合，形成一種厚約15 nm的間隙連接，這種連接可允許分子量小于1 000的水溶性分子通過，使VSMC能有效接受VEC產(chǎn)生的第二信息，從而對VSMC本身的收縮表型狀態(tài)起到穩(wěn)定作用。因此也將VEC-VSMC細胞連接稱之為肌-內(nèi)皮連接耦系統(tǒng)。在血管外科領(lǐng)域，所關(guān)心的是在活體組織中，如果這一耦聯(lián)系統(tǒng)受損，近內(nèi)側(cè)彈力膜處VSMC是否可自收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇蜖顟B(tài)，因為合成表型VSMC是參與并導(dǎo)致血管內(nèi)膜的過度增生(IH)從而引起血管腔狹窄主要細胞。從本研究所采用的靜脈移植動物模型中通過電鏡觀察到，移植靜脈中肌內(nèi)皮連接結(jié)構(gòu)因人為造成的對血管的牽拉和血管自身的缺血缺氧等因素的作用，VEC與VSMC之間的連接消失。并且，VEC受損或脫落，合成表型VSMC較收縮表型VSMC相對增多。肉眼條件下即可觀察到移植靜脈管腔顯著狹窄。因此推測出肌內(nèi)皮連接耦聯(lián)系統(tǒng)應(yīng)是影響VSMC表型轉(zhuǎn)化態(tài)的重要結(jié)構(gòu)之一。就移植靜脈而言，在移植早期重塑這一結(jié)構(gòu)，對VSMC收縮表型的穩(wěn)定或合成型的轉(zhuǎn)態(tài)應(yīng)能發(fā)揮重要的生物效應(yīng)。本研究在基因轉(zhuǎn)染的移植靜脈早期，有VEC-VSMC細胞連接形成。這一研究結(jié)果表明，VEC-VSMC細胞連接這一信息通路是穩(wěn)定移植靜脈重塑早期VSMC轉(zhuǎn)化態(tài)重要的組織結(jié)構(gòu)之一。

1 溫進坤，石 纓.血管平滑肌細胞增殖調(diào)控機理的研究進展〔J〕.物理學(xué)進展，1996;27(2):149-52.

2 SongW.Phecotypic changes of vascular smooth muscle cells and their fuction significance〔J〕.Med Invest Communi，1993;22(4):10-3.

3 Saito Y.Mechanism of phenotypic formation of smooth muscle cells〔J〕.Ann N Y Acad Sci，1995;748(1):7-10.

4 Kocher O，Gabbiani G，Reidy MA，et al.Phenotypic feature of smooth muscle cells during the evolution of experimental carotide artery intimal thickening.Biochemical and morphological studies〔J〕.Lab Invest，1991;65(4):459-70.