代立娟 王 琳 馮 瀾 (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，黑龍江 佳木斯 154003)

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是引起人類呼吸道感染的主要病毒之一，也是引起嬰幼兒病毒性肺炎和毛細(xì)支氣管炎的重要病原體，尤其是早產(chǎn)兒、先天性心臟病患兒、免疫缺陷的嬰兒和兒童更容易發(fā)生嚴(yán)重RSV感染。迄今為止，在預(yù)防上尚未發(fā)現(xiàn)有效的疫苗;目前病毒性疾病的治療至今仍缺乏特異性強(qiáng)的藥物〔1，2〕，而且大多數(shù)藥物存在嚴(yán)重不良反應(yīng)。肉桂(Cinnamomum cassia Presl)原名菌桂、牡桂，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。肉桂揮發(fā)油中的主要化學(xué)成分為肉桂醛(cinnamaldehyde又名桂皮醛)，占52.92% ～61.20%。研究表明，肉桂醛具有很強(qiáng)的醫(yī)學(xué)價(jià)值，抗菌作用〔3，4〕抗血小板聚集、抗凝血作用〔5〕抗腫瘤〔6〕升高體表溫度〔7〕，除臭〔8〕、抗突變作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有腎上腺素樣作用〔9〕等。肉桂醛是存在于天然藥物肉桂中的一種有效成分，具有廣泛的藥理作用，活性較強(qiáng)，可用于治療多種疾病，具有廣泛的臨床用途和開發(fā)前景。本實(shí)驗(yàn)擬通過體外實(shí)驗(yàn)，研究驗(yàn)證肉桂醛的抗RSV的能力，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株和細(xì)胞株 HeLa細(xì)胞株和RSV病毒株，由佳木斯大學(xué)病理生理學(xué)教研室保存。主要試劑肉桂醛、噻唑藍(lán)(MTT)購于Sigma;;胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)液購于Invitrogen;二甲基亞砜(DMSO)購于上海菲達(dá)有限公司。

1.2 藥物配制 用RPMI-1640培養(yǎng)液將肉桂醛(10 mg/ml)進(jìn)行倍比稀釋。使藥物濃度成 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256比例，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒毒力測(cè)定 以50%細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染量(CCID50)表示病毒毒力。將1 ml病毒接種于已生長(zhǎng)達(dá)到70%的HeLa細(xì)胞中，放入37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h，加入2 ml 2%的培養(yǎng)液，待細(xì)胞發(fā)生變性反應(yīng)后采取反復(fù)凍融的方法收集病毒液。然后將提純過濾的病毒培養(yǎng)液進(jìn)行10倍系列稀釋，使病毒液濃度為10-1、10-2、10-3……10-10。每一稀釋度設(shè)立8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白陰性對(duì)照，37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，同時(shí)觀察記錄細(xì)胞病變(CPE)。用 Reed-Muench法求出對(duì)細(xì)胞的CCID50。

1.4 肉桂醛對(duì)HeLa細(xì)胞毒性測(cè)定 將HeLa細(xì)胞接種至96孔中培養(yǎng)，待長(zhǎng)成單層時(shí)，將已稀釋成不同濃度的肉桂醛，分別加入96孔板中培養(yǎng)，每個(gè)濃度重復(fù)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立一個(gè)正常細(xì)胞對(duì)照孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)觀察3 d，觀察HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，吸取培養(yǎng)板中液體，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液沖液沖洗3次，在向每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸去上清后，每孔加200μl DMSO，微量振蕩器振蕩5 min，酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(波長(zhǎng)490 nm)測(cè)吸光度值。并將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 肉桂醛對(duì)RSV的作用研究

1.5.1 對(duì)呼吸道合胞病毒的直接滅活作用 將HeLa細(xì)胞接種至96孔中培養(yǎng)，在肉桂醛的無毒濃度范圍內(nèi)，將不同濃度的肉桂醛分別與100 CCID50RSV液等量混合，37℃、CO2培養(yǎng)箱作用2 h后，將其接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃ CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，棄上清，加入維持液200μl，每一濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，并且實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組，然后將其置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞致變反應(yīng)。當(dāng)病毒對(duì)照組細(xì)胞病變達(dá)75%以上，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.5.2 在病毒復(fù)制階段肉桂醛對(duì)呼吸道合胞病毒的作用 將HeLa細(xì)胞接種至96孔中培養(yǎng)，在長(zhǎng)成單層HeLa細(xì)胞的96孔板上，每孔接種20μl的100 CCID50呼吸道合胞病毒病毒液，37℃ CO2培養(yǎng)箱吸附2 h，吸棄病毒液。在藥物無毒范圍內(nèi)加入不同濃度的肉桂醛，每孔200μl，每一濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照，其余方法同1.5.1。

1.5.3 對(duì)RSV吸附的作用 在藥物無毒范圍內(nèi)，不同濃度的肉桂醛分別與100 CCID50的RSV液等量混合后，立即加到已長(zhǎng)成單層HeLa細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃ CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，棄去96孔板中液體，加維持液200μl，每一濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照，其余方法同1.5.1。

1.5.4 對(duì)HeLa細(xì)胞的保護(hù)作用 在藥物無毒范圍內(nèi)，每孔細(xì)胞預(yù)先加入不同濃度的肉桂醛200μl，37℃作用4 h，然后用PBS洗滌三次，每孔再加入100 CCID50呼吸道合胞病毒，吸附2 h，棄病毒上清，加維持液200μl，每一濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照，其余方法同1.5.1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS49.13版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用Linear-Regression方法計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度 (TC50)、半數(shù)有效濃度 (IC50)和對(duì)藥物劑量與其產(chǎn)生的細(xì)胞效應(yīng) (細(xì)胞存活率、抑制率)進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷是否存在量效關(guān)系。組間比較采用方差分析。HeLa細(xì)胞存活率 (%)=藥物組吸光度值/細(xì)胞對(duì)照組吸光度值 ×100%，抑制率 (%)=100%-存活率。病毒抑制率=(藥物處理組吸光度值-病毒對(duì)照組吸光度值)/(細(xì)胞對(duì)照組吸光度值-病毒對(duì)照組吸光度值)×100%。距離比例=高于50%病變累積陽性百分?jǐn)?shù)-50%/(高于50%累積陽性百分?jǐn)?shù)-低于50%累積陽性百分?jǐn)?shù))。治療指數(shù) (TI)=半數(shù)毒性濃度 (TC50)/半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2 結(jié)果

2.1 病毒毒力測(cè)定 用顯微鏡觀察細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)(CPE)，與正常細(xì)胞相比，RSV感染后的Hela細(xì)胞水腫變圓，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，甚至出現(xiàn)融合，細(xì)胞彼此相連呈串樣改變。當(dāng)50%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，視為CPE陽性細(xì)胞，對(duì)72 h未出現(xiàn)細(xì)胞病變的細(xì)胞，視為CPE陰性細(xì)胞。采用Reed-Muench法計(jì)算RSV在Hela細(xì)胞中的CCID50為106.65，實(shí)驗(yàn)中病毒攻擊量為100 CCID50/100 μl為104.65。見圖1。

2.2 肉桂醛對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性作用 肉桂醛對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為形態(tài)改變(由梭形變?yōu)閳A形)、細(xì)胞間質(zhì)高度水腫，甚至有部分細(xì)胞破碎脫落漂浮、細(xì)胞增殖緩慢、細(xì)胞顆粒增多、折光性增強(qiáng)等。隨著藥物濃度的降低而毒性降低，細(xì)胞活力逐漸增加。肉桂醛的安全范圍為0.001 563～0.003 125 g/L。

2.3 肉桂醛的抗RSV作用研究 光鏡下觀察正常細(xì)胞的對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液清亮，細(xì)胞呈多邊形或梭形、菱形，排列整齊緊密，細(xì)胞間隔清晰，可幼稚連接，連接不緊密，胞質(zhì)清楚;病毒對(duì)照組的HeLa細(xì)胞在病毒的直接滅活、病毒復(fù)制增殖的抑制作用、病毒吸附階段的HeLa細(xì)胞的CPE表現(xiàn)為:細(xì)胞膜、核膜和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)破壞，線粒體空泡變化，細(xì)胞腫脹、變圓、細(xì)胞間融合、脫落、細(xì)胞呈串狀改變，細(xì)胞崩解，胞質(zhì)及其內(nèi)容物外泄，最后崩解壞死脫落;而在藥物作用組(除對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用)大部分HeLa細(xì)胞的形態(tài)基本與正常形態(tài)沒有太大變化，僅有部分細(xì)胞出現(xiàn)改變，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞呈皺縮狀，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀。見圖2，圖3。

圖1 不同濃度肉桂醛下的HeLa細(xì)胞的存活率

圖2 各組HeLa細(xì)胞(×200)

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在病毒的直接滅活、病毒復(fù)制增殖的抑制作用、病毒吸附階段(除細(xì)胞保護(hù)作用下)三種作用方式，肉桂醛在這三種形式中隨著藥物濃度的增加HeLa細(xì)胞的存活率，從而達(dá)到抑制RSV的增殖作用。且在有效的無毒范圍內(nèi)的肉桂醛和HeLa細(xì)胞存活率之間呈現(xiàn)一定的聯(lián)系。表現(xiàn)在隨著肉桂醛濃度(在無毒范圍內(nèi))的增加，細(xì)胞形態(tài)改變、融合壞死脫落等典型CPE特征逐漸減弱，大部分HeLa細(xì)胞的形態(tài)基本與正常形態(tài)沒有太大變化，細(xì)胞存活率明顯升高。見表1，表2。直接滅活、生物合成、吸附作用的 IC50分別為 0.001 2、0.003 5、0.003 0，TI分別為 31.25、10.71、12.50。

表1 不同方式作用下肉桂醛對(duì)RSV的細(xì)胞致病變效應(yīng)

圖3 肉桂醛的抗RSV作用(×200)

表2 不同方式作用下HeLa細(xì)胞的存活率(%)

3 討論

RSV廣泛流行于世界各地，它是引起嬰幼兒呼吸道感染的最重要的病原微生物之一，也常引起成人特別是老年人感染，它可以引起不同程度的感染甚至是重癥感染，同時(shí)也是導(dǎo)致某些免疫抑制人群發(fā)病和死亡的重要原因。RSV一般通過空氣飛沫和密切接觸傳播傳播，感染途徑容易實(shí)現(xiàn)。RSV的感染多見于新生兒和6個(gè)月以內(nèi)的嬰兒，男多于女。我國北方多見于冬春季，南方則多見于春夏季。RSV是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副黏液病毒科，外被包膜，能吸附宿主細(xì)胞，細(xì)胞間黏附分子囊膜表面的跨膜糖蛋白有融合蛋白F、吸附蛋白G和小疏水蛋白SH，它們介導(dǎo)病毒黏附，能使RSV吸附于宿主細(xì)胞上，從而導(dǎo)致感染的開始能引起病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜融合，有利于病毒穿入細(xì)胞。因而要求抗病毒藥物既能有效地抑制病毒的增殖，而又不損傷宿主細(xì)胞。中藥同西藥相比具有篩選時(shí)間短，資源豐富，同時(shí)又可以節(jié)省人力、物力、財(cái)力，而且具有毒性低和副作用小等傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)。肉桂醛是肉桂油中的主要物質(zhì)，肉桂醛的許多要用作用已經(jīng)應(yīng)用與臨床，本實(shí)驗(yàn)主要研究肉桂醛抗RSV的作用機(jī)制。首先檢測(cè)肉桂醛的最大無毒濃度和CCID50，然后采用CPE和MTT方法檢測(cè)做相關(guān)分析。結(jié)果顯示肉桂醛治療組(病毒的直接滅活作用方式;病毒復(fù)制增殖的抑制作用方式;病毒吸附的抑制作用方式)細(xì)胞形態(tài)正常，僅有少量細(xì)胞出現(xiàn)異常的形態(tài)及結(jié)構(gòu)改變，說明肉桂醛在病毒的直接滅活作用方式、病毒復(fù)制增殖的抑制作用方式、病毒吸附的抑制作用方式下具有抑制RSV的作用。在肉桂醛的無毒范圍內(nèi)，隨著肉桂醛藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯增加。但是在細(xì)胞保護(hù)方式作用下，研究證明，肉桂醛組細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞間融合、線粒體空泡，細(xì)以及細(xì)胞的脫落壞死等CPE病變、細(xì)胞存活率以及藥物濃度與病毒組都沒有明顯差別。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肉桂醛有抑制RSV作用，肉桂醛在三種作用方式下(直接滅活階段病毒復(fù)制階段和病毒吸附階段)具有抗RSV作用。肉桂醛具能明顯抑制RSV的生物學(xué)合成，但是不能保護(hù)宿主細(xì)胞預(yù)防RSV的入侵;對(duì)肉桂醛的抗RSV作用的臨床作用尚待進(jìn)一步研究。

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