蘇 海 賀學(xué)農(nóng) 陳 皓 周昌龍 夏小輝 張 毅 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 402160)

中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，廣泛存在于中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)，在機(jī)體的組織損傷、炎癥反應(yīng)等病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。研究表明NE與腦出血、缺血再灌注等神經(jīng)系統(tǒng)損害有關(guān)〔1，2〕，但是NE與顱腦損傷后的繼發(fā)性腦損傷的關(guān)系尚未有報(bào)道。本研究采用液壓打擊制作顱腦損傷(TBI)大鼠模型，檢測(cè)腦組織的NE、血腦屏障(BBB)通透性以及腦組織含水率的動(dòng)態(tài)變化，探討腦組織NE含量的變化對(duì)顱腦損傷后的繼發(fā)性腦水腫的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性健康SD大鼠48只，體重200～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分為對(duì)照組8只和TBI組40 只，其中 TBI組又按6、24、48、72、168 h 時(shí)間點(diǎn)分為 5個(gè)亞組，每亞組8只大鼠，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，造模后SD大鼠按亞組分籠飼養(yǎng)，正常喂食、喂水。

1.2 TBI模型制作 采用 Thompson〔3〕方式制作模型，用100 g/L水合氯醛(3 ml/kg)經(jīng)腹腔麻醉大鼠，用立體定位儀固定頭部，作頭皮正中切口，剝離骨膜，前囟人字縫尖連線中點(diǎn)偏左4 mm顱骨鉆鉆孔，暴露完整硬腦膜。打擊管內(nèi)注滿(mǎn)水，與液壓腦創(chuàng)傷打擊裝置連接，造成TBI。

1.3 腦組織NE的測(cè)定 對(duì)照組和TBI組大鼠分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)水合氯醛麻醉后，快速斷頭取腦，取腦組織精確稱(chēng)重，置于-70℃保存?zhèn)錅y(cè)。測(cè)定時(shí)將腦組織用生理鹽水在冰浴環(huán)境內(nèi)以玻璃勻漿器制成10%的腦組織勻漿。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗夾心法(ELISA)測(cè)定。

1.4 BBB通透性的檢測(cè) 對(duì)照組和TBI組大鼠于預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)用2%偶氮藍(lán)(EB)按5 ml/kg經(jīng)股靜脈注入，60 min后，處死大鼠，取大鼠腦組織通過(guò)分光光度計(jì)定檢測(cè)滲出的EB。

1.5 腦含水率測(cè)定 對(duì)照組和TBI組大鼠在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)水合氯醛麻醉后，迅速斷頭取腦，將取出的腦組織放在用生理鹽水浸潤(rùn)過(guò)的濾紙上，以防止水分蒸發(fā)。去除軟腦膜和血跡，精密稱(chēng)重。將腦組織置于95℃恒溫烘箱24 h，再稱(chēng)取干重。按Blliot公式計(jì)算腦含水率=(濕重-干重)/濕重×100%。

2 結(jié)果

2.1 TBI大鼠腦組織內(nèi)NE含量的動(dòng)態(tài)變化 TBI大鼠腦組織內(nèi)NE含量在6 h開(kāi)始增高，24 h進(jìn)一步升高，48 h達(dá)到最高峰，72 h開(kāi)始逐漸下降，直到168 h仍維持在高水平，TBI組各時(shí)間點(diǎn)的腦組織NE含量均高于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 TBI大鼠腦組織EB含量的動(dòng)態(tài)變化 腦組織EB含量與NE含量的變化呈同步性，TBI組各時(shí)間點(diǎn)的腦組織EB含量均高于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)腦組織NE、EB含量、腦含水量的比較(x ± s，n=8)

2.3 TBI大鼠腦組織含水率的動(dòng)態(tài)變化 TBI組大鼠腦組織含水率在6 h開(kāi)始增高，24、48 h進(jìn)一步升高，72 h達(dá)到最高峰，168 h開(kāi)始逐漸下降，TBI組各時(shí)間點(diǎn)的腦組織含水率均高于對(duì)照組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

3 討論

腦水腫是創(chuàng)傷性顱腦損傷后繼發(fā)的主要病理生理改變之一，常影響病情的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，甚至危及患者的生命。由顱腦創(chuàng)傷導(dǎo)致的腦組織水腫是細(xì)胞毒性和血管源性的混合性水腫，并且以細(xì)胞毒性腦水腫為主〔4〕。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷后腦水腫進(jìn)行了深入研究，其病理生理過(guò)程，分子生物學(xué)機(jī)制及愈后評(píng)價(jià)指標(biāo)均有較大進(jìn)展，特別是分子生物學(xué)方面進(jìn)展進(jìn)一步揭示了TBI繼發(fā)損傷過(guò)程。無(wú)論是血管源性腦水腫還是細(xì)胞毒性腦水腫都離不開(kāi)炎癥介質(zhì)的參與〔5〕，其中NE作為創(chuàng)傷后的重要炎性介質(zhì)，廣泛地參與到創(chuàng)傷后繼發(fā)的病理生理改變過(guò)程中。

本研究采用液壓打擊方法制作TBI大鼠模型是一種成熟的TBI模型，操作過(guò)程相對(duì)比較簡(jiǎn)單，模型穩(wěn)定，已經(jīng)廣泛的運(yùn)用于TBI的各種實(shí)驗(yàn)研究中。EB是一種經(jīng)典的BBB示蹤劑，進(jìn)入血液后與血清蛋白結(jié)合形成EB-白蛋白復(fù)合物。正常情況下，這種復(fù)合物不能通過(guò)BBB，但在顱腦創(chuàng)傷后存在BBB完整性的破壞，EB-白蛋白復(fù)合物可以通過(guò)破壞的BBB進(jìn)入腦組織間隙，而EB的滲出量與BBB的破壞程度呈正比。本實(shí)驗(yàn)可以反映BBB破壞程度，間接地反映BBB的通透性〔6〕。NE與BBB屏障通透性變化的同步性說(shuō)明了NE含量的增加，可能是BBB通透性增高的原因之一。NE是由類(lèi)溶酶體結(jié)構(gòu)的嗜苯胺藍(lán)顆粒釋放的一種絲氨酸蛋白水解酶，NE可以分解周?chē)鞍踪|(zhì)和破壞組織結(jié)構(gòu)，可以降解彈性蛋白、膠原蛋白、纖維連接蛋白等，纖維連接蛋白受損，則血管通透性增高〔7〕。研究人員通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外源性NE能夠破壞或分解表面活性物質(zhì)的主要成分表面活性蛋白SP-A、SP-B、SP-C，導(dǎo)致肺泡表面張力增加，降低肺組織順應(yīng)性，促進(jìn)血漿滲漏，引起肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮通透性增高〔8〕。BBB通透性增高是導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦水腫的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)TBI大鼠腦組織含水率的變化與NE含量和BBB通透性增高并不完全同步，NE含量增加和BBB通透性增高的高峰期出現(xiàn)在創(chuàng)傷后48 h，而含水率的最高峰發(fā)生在72 h，這種高峰的延遲說(shuō)明TBI首先引起NE等炎癥介質(zhì)的含量變化，通常影響B(tài)BB通透性，進(jìn)一步加重了血管性腦水腫，而NE等炎性介質(zhì)也可能進(jìn)一步加重細(xì)胞毒性水腫的程度。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:實(shí)驗(yàn)性TBI大鼠腦組織內(nèi)NE含量的升高與腦組織水腫密切相關(guān)，NE增加可能是TBI后早期引起B(yǎng)BB通透性增加、血管源性腦水腫形成的重要原因之一。在TBI發(fā)生的過(guò)程中，腦組織創(chuàng)傷使腦組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，激活的中性粒細(xì)胞釋放大量的NE，從而降解彈性蛋白、蛋白多糖和膠原，導(dǎo)致組織、細(xì)胞和血管基底膜損傷，因此推測(cè)NE是引起血管損傷的重要因素之一，是TBI繼發(fā)性腦水腫形成的重要原因，這一發(fā)現(xiàn)可能將為治療TBI后腦水腫開(kāi)辟一新的途徑。

1 Shimakura A，Kamanaka Y，Ikeda Y，et al.Neutrophil elastase inhibition reduces cerebral ischemic damage in the middle cerebral artery occlusion〔J〕.Brain Res，2000;858(1):55-60.

2 胡 月，董 志，晏 飛.西維來(lái)司鈉對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(6):1459-62.

3 Thompson HJ.Lateral fluid percussion brain injury:a 15-year review and evaluation〔J〕.Neurotrauma，2005;22(10):42-75.

4 Marmarou A.Pathophysiology of traumatic brain edema:current concepts〔J〕.Acta Neurochir Suppl，2003;86:7-10.

5 Donkin JJ，Vink R.Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury:therapeutic developments〔J〕.Curr Opin Neurol，2010;23(3):293-9.

6 胡 俊，丁仕義，黎海濤，血腦屏障開(kāi)放的檢測(cè)方法〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)雜志，2003;32(12):1774-6.

7 Carden D，Xiao F，Moak C，et al.Neutrophil elastase promotes lung microvascular injury and proteolysis of endothelial cadherins〔J〕.Am J Physiol，1998;275:H385-92.

8 Hagio T，Matsumoto S，Nakao S，et al.Sivelestat，a specific neutrophil elastase inhibitor，prevented phorbolmyristate acetate-induced acute lung injury in conscious rabbits〔J〕.Pulmon Pharmacol Thera p，2005;18:285-91.