徐廣會 秦新月 陶 濤 程 創(chuàng) (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016)

腦缺血早期血管梗阻引起血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死凋亡，細(xì)胞間連接受到破壞，進(jìn)而引起血腦屏障的破壞，造成后續(xù)級聯(lián)反應(yīng)。因此保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞或者維持血管的穩(wěn)定是有效的解決缺血早期腦損傷的重要途徑。fibulin-5作為一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白因?yàn)閺V泛的細(xì)胞功能而備受關(guān)注，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜的黏附，降低內(nèi)皮細(xì)胞遷移，因而在血管穩(wěn)定方面成為近年來的研究熱點(diǎn)，但其在腦缺血過程中所起的作用值得探討。本研究擬通過構(gòu)建大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察fibulin-5在缺血再灌注早期的表達(dá)變化規(guī)律，為探索治療缺血性腦血管病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 兔抗fibulin-5多克隆抗體(Santa)，小鼠抗CD31單克隆抗體(BD)，Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(綠光)、Alexa Fluor 594標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(上海碧云天)，RNAiso plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(Takara)，PCR引物(上海生工)，Western印跡檢測相關(guān)試劑(上海碧云天)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組 選用健康雄性清潔級SD大鼠96只，體質(zhì)量230～280 g，鼠齡3～4月齡，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。分為6組各16只，分別為正常組、假手術(shù)組、中腦動脈閉塞(MCAO)模型6 h組、24 h組、48 h和72 h組。術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.3 模型制備及神經(jīng)功能評分 參照Longa線栓法，并根據(jù)改良法制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型，大鼠清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評分，神經(jīng)功能評分采用Zea Longa評分法:1～3分者入組，0分和4分者均被剔除。到達(dá)時間點(diǎn)取材時若發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者也剔除。所有剔除者隨機(jī)補(bǔ)充。

1.4 激光共聚焦檢測腦組織內(nèi)fibulin-5的表達(dá) 取大鼠缺血側(cè)腦組織制備冰凍切片(片厚20μm)，-80℃保存。取出晾干，放入丙酮中固定30 min，PBS沖洗后放入枸櫞酸鹽中進(jìn)行微波修復(fù)，待自然冷卻后 PBS沖洗，加入0.4%Triton破膜，37℃孵育30 min，PBS沖洗后封閉血清37℃孵育30 min，甩干血清，加入兔抗大鼠fibulin-5多克隆抗體和小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體(稀釋濃度均為1∶50)的混合液，4℃過夜。第二天將切片放入37℃復(fù)溫1 h，PBS沖洗后，在避光情況下加入Alex 488(羊抗小鼠，綠光)和Alex 596(羊抗兔，紅光)的混合二抗(稀釋濃度均為1∶100)，37℃孵育2 h后PBS沖洗，50%甘油封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測腦組織中fibulin-5 mRNA的表達(dá)水平 取大鼠右側(cè)大腦半球缺血區(qū)部分腦組織，嚴(yán)格按照RNA提取說明書進(jìn)行每個樣本的總 RNA提取，測定其260和280 nm光密度比值在1.9～2.2，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照熒光定量試劑盒的說明書進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。β-actin作為內(nèi)參。引物序列分別為:fibulin-5上游5'-GCCCTACTCCAATCCCTACTCT-3'，下 游 5'-TACCCTCCTTCCGTGTTGATAC-3';β-actin 上游 5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，下游 5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。擴(kuò)增條件為 95℃預(yù)變性2 min;95℃ 變性 5 s，60℃ 退火 34 s，40 個循環(huán);72℃ 延伸10 min。根據(jù)相對定量(RQ)法計(jì)算fibulin-5 mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 Western印跡檢測腦組織中fibulin-5的表達(dá) 取大鼠大腦半球缺血區(qū)部分腦組織提取全蛋白，使用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離等量的蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。將膜浸入TBST5%脫脂奶粉中37℃封閉1 h，封閉后加入1∶100稀釋的兔抗大鼠fibulin-5多克隆抗體4℃過夜。第2天37℃復(fù)溫1 h，TBST清洗后1∶2 000稀釋的羊抗兔IgG 37℃孵育2 h。多次清洗后，加入顯影劑，使用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描拍照。結(jié)果以 Quantity One圖像進(jìn)行條帶分析，以fibulin-5/β-actin條帶密度的相對值表示蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 激光共聚焦檢測腦組織中fibulin-5的表達(dá) CD31主要標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞，能夠特異性地定位組織中的血管。激光共聚焦結(jié)果顯示，fibulin-5主要分布在內(nèi)皮細(xì)胞之間，也可在實(shí)質(zhì)細(xì)胞或者血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)見圖1。

圖1 激光共聚焦檢測腦組織內(nèi)fibulin-5的表達(dá)(箭頭所示，×200)

2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測腦組織內(nèi)fibulin-5 mRNA的表達(dá)水平 fibulin-5 mRNA表達(dá)量模型組各時間點(diǎn)與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Fibulin-5 mRNA的表達(dá)從缺血再灌注6 h(1.25±0.01)逐漸升高，24 h(1.47±0.06)達(dá)到高峰，隨后開始降低，但48 h(1.21±0.38)、72 h(1.13±0.03)時仍高于假手術(shù)組(1.02±0.01，P＜0.05)。正常組與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Western印跡檢測腦組織內(nèi)fibulin-5蛋白表達(dá)量 fibulin-5蛋白表達(dá)缺血再灌注各組與假手術(shù)組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。缺血再灌注缺血側(cè)腦組織fibulin-5蛋白的表達(dá)趨勢與fibulin-5 mRNA表達(dá)趨勢相似。與假手術(shù)組(0.30±0.14)相比，缺血再灌注各組腦組織fibulin-5蛋白表達(dá)從再灌注6 h(1.26±0.46)逐漸升高，再灌注24 h(1.78±0.48)達(dá)到高峰，72 h(0.89±0.27)時有所下降，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)。正常組與假手術(shù)組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

圖2 Western印跡檢測缺血側(cè)腦組織fibulin-5蛋白表達(dá)量

3 討論

Fibulin-5是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，因?yàn)閺V泛的細(xì)胞功能而備受關(guān)注，在組織的形成、重建和修復(fù)等各種生理過程中都起著關(guān)鍵的作用〔1〕，其表達(dá)缺失與腫瘤和生殖器官脫垂等病理過程有著密切的關(guān)系〔2〕。Anna等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的fibulin-5表達(dá)水平明顯升高，這與本研究有相似之處。

Fibulin-5在正常成人血管中表達(dá)較低，但是在球囊撤出引起的血管損傷、頸動脈結(jié)扎以及動脈粥樣硬化斑塊激活的內(nèi)皮細(xì)胞中有大幅度的上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)可以增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附力，降低內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，對血管的穩(wěn)定起到促進(jìn)作用。在大多數(shù)腫瘤形成過程中，fibulin-5的表達(dá)降低使得腫瘤內(nèi)出現(xiàn)大量畸形新生血管，而fibulin-5的過表達(dá)可以抑制新生血管的生長，進(jìn)而抑制腫瘤的生長〔4〕。Fibulin-5含有能與整聯(lián)蛋白結(jié)合的RGD基序(integrin-binding RGD motif)，這一基序能介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附，能與細(xì)胞表面的整合素 ανβ3、ανβ5和 α9β1結(jié)合〔5〕。Preis 等〔6，7〕通過離體研究發(fā)現(xiàn) fibulin-5 能夠通過 RGD與整合素的結(jié)合增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞間以及內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附力，而過度表達(dá)fibulin-5的內(nèi)皮細(xì)胞能夠明顯增強(qiáng)其黏附力以及對抗剪切力的能力。另外，過表達(dá)的fibulin-5能夠競爭纖連蛋白與α5β1整合素的結(jié)合，抑制ROS的表達(dá)，從而降低缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞的死亡〔6〕。因此，離體條件下已經(jīng)證實(shí)了的fibulin-5過表達(dá)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用能否在在體條件下發(fā)揮同樣的作用將是以后研究的重點(diǎn)。缺血再灌注條件下fibulin-5的表達(dá)明顯升高，這一表達(dá)變化可能會激活腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞，阻滯內(nèi)皮細(xì)胞的死亡，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜的黏附，以及通過調(diào)節(jié)缺血后腦組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而對腦損傷起到保護(hù)作用。我們將在后續(xù)的課題中重點(diǎn)對fibulin-5作用于腦血管的分子機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

1 Spencer JA，Hacker SL，Davis EC，et al.Altered vascular remodeling in fibulin-5-deficient mice reveals a role of fibulin-5 in smooth muscle cell proliferation and migration〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102:2946-51.

2 Soderberg MW，Bystrom B，Kalamajski S，et al.Gene expressions of small leucine-rich repeat proteoglycans and fibulin-5 are decreased in pelvic organ prolapse〔J〕.Mol Hum Reprod，2009;15:251-7.

3 Anna Guadall，Mar Orriols，Ricardo Rodriguueze，et al.Fibulin-5 is upregulated by hypoxia in endothelial cells through a hypoxia-inducible factor-1(HIF-1α)-dependent mechanism〔J〕.J Biol Chem，2011;286(9):7093-103.

4 Albig AR，Neil JR，Schiemann WP.Fibulins3 and 5 antagonize tumor angiogenesis in vivo〔J〕.Cancer Res，2006;66:2621-9.

5 Albig AR，Schiemann WP.Fibulin-5 antagonizes vascular endothelial growth factor(VEGF)signaling and angiogenic sprouting by endothelial cells〔J〕.DNA Cell Biol，2004;23(6):367-79.

6 Preis M，Cohen T，Sarnatzki Y，et al.Effects of fibulin-5 on attachment，adhesion，and proliferation of primary human endothelial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2006;348(3):1024-33.

7 Schiemann WP，Blobe GC，Kalume DE，et al.Context-specific effects of fibulin-5(DANCE/EVEC)on cell proliferationg motility，and invasion.Fibulin-5 is induced by transforming growth factor-beta and affects protein kinase cascades〔J〕.JBiol Chem，2002;277(30):27367-77.