遲 杰，郝雪龍

(天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072)

鄰苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters，簡稱PAEs)，別名酞酸酯，在化學(xué)工業(yè)中被普遍用做塑料的增塑劑和軟化劑.研究表明，PAEs 具有致癌、致畸和致突變性，在生物體內(nèi)會產(chǎn)生多種擾亂動物內(nèi)分泌的生化效應(yīng)[1].世界衛(wèi)生組織已于1995年將PAEs 列為必須控制的能擾亂人體內(nèi)分泌功能的化學(xué)物質(zhì);美國環(huán)保局和我國也將其列為優(yōu)先控制污染物.我國水體中PAEs 污染相對嚴(yán)重，大部分水體沉積物中酞酸二丁酯(DBP)和酞酸二異辛酯(DEHP)的濃度已超過美國華盛頓州的警戒值[2].

植物修復(fù)是目前水體生物修復(fù)技術(shù)的一種，因其經(jīng)濟(jì)、對環(huán)境破壞性小等優(yōu)點被人們廣泛應(yīng)用[3].沉水植物一方面能夠通過莖葉富集降解水中有機(jī)污染物[4];另一方面由于根生底質(zhì)，根系分泌的營養(yǎng)物質(zhì)可以提高根際微生物的數(shù)量和降解活性，從而提高微生物對沉積物的修復(fù)作用[5].其中，微生物降解是沉積物中污染物的主要消減途徑[6].磷脂是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，不同種類微生物體內(nèi)磷脂脂肪酸(PLFA)的組成及含量差異顯著，可反映微生物的生物量及群落結(jié)構(gòu)信息，已被廣泛用于微生物生態(tài)研究[7].目前，有關(guān)沉水植物的研究主要集中在氮、磷元素的去除，鮮見對沉積物中有機(jī)污染物去除作用的報道.

菹草是春季淺水湖泊、河流和水庫中占據(jù)主體的沉水植物，覆蓋面積可達(dá)20% ～70%[8].本論文利用菹草作為受試植物，模擬海河水環(huán)境建立菹草微宇宙，研究菹草對沉積物中酞酸酯的去除作用，以及根際和非根際沉積物中微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的變化，分析去除作用機(jī)制.研究結(jié)果可為沉水植物根際污染物修復(fù)機(jī)理提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 沉積物前處理與植株的獲得

采集海河表層15 cm 的沉積物，于通風(fēng)處自然陰干，壓碎，過2 mm 篩.用丙酮溶解一定量的DBP 和DEHP，噴灑于1/6 的沉積物中.翻動沉積物使溶劑揮發(fā)，然后噴灑蒸餾水，使其含水量為60%，再經(jīng)濕法滅菌后(每天1 次，連續(xù)3 d)置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中一個月，中間定期補(bǔ)充水分.取出染毒沉積物，攤開，快速風(fēng)干后，與剩余5/6 未染毒沉積物混合并再次過2 mm 篩，備用.

從天津大學(xué)敬業(yè)湖采集菹草，組織培養(yǎng)繁殖后[9]，放入經(jīng)過曝氣的自來水中備用.

1.2 微宇宙系統(tǒng)的建立和樣品采集

為研究菹草對沉積物中DBP 和DEHP 去除作用，實驗采用2 組微宇宙系統(tǒng)，即有草組和無草對照組.具體方法是:取30 cm×60 cm×40 cm 的玻璃水族箱2 個，底部鋪約3 cm 厚已染毒的海河沉積物.采用根袋法[10]區(qū)分根際土與非根際土，根袋直徑2 cm，2 個根袋間隔2.5 cm，一個水族箱放置21 個根袋，每個根袋栽種5 g 菹草.向每個缸中加入約20 L 經(jīng)曝氣的自來水，穩(wěn)定2 d 開始計時.實驗期間光照強(qiáng)度為2200 ±100 lx，光暗比為12 h∶12 h，溫度為25 ±1℃.實驗連續(xù)運(yùn)行27 d.每隔一定時間采集水、沉積物(根際和非根際)和菹草的樣品，并在實驗結(jié)束時收集菹草根系，分析DBP 與DEHP 的濃度.取1、15 和27 d 的沉積物測定磷脂脂肪酸(PLFA)含量.

1.3 樣品的制備和分析

1.3.1 酞酸酯的分析 水樣:用虹吸法取水表面下10 cm 左右的水樣10 ml，置于25 ml 具塞比色管中，加入1 ml 二氯甲烷，充分振搖10 min，靜置分層，共萃取3 次，合并有機(jī)相后N2吹定容.

植物樣:取植物的莖葉或根系部分，蒸餾水沖洗后吸干表面水分，稱取1 g(鮮重)，剪碎后放入組織研磨器，加5 ml 二氯甲烷，研磨5 min.移出植物勻漿至40 ml 離心管中，4000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min.吸取二氯甲烷層至K-D 濃縮器后N2吹定容.

沉積物樣:取1 g 沉積物(冷凍干燥后過80 目篩)于10 ml 離心管中，加3 ml 二氯甲烷，超聲萃取10 min，然后4000 轉(zhuǎn)/min 離心5 min，重復(fù)3 次合并有機(jī)相，N2吹定容.

以上每個樣品均做3 個平行，不同樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析.樣品分析采用Agilent 6890 N 型氣相色譜儀，配 FID 檢測器;色譜柱為 HP-5 型石英毛細(xì)管柱(30.0 m×320 μm×0.25 μm);進(jìn)樣口 250℃，檢測器250℃;N2流量25 ml/min，H2流量45 ml/min，空氣流量450 ml/min;進(jìn)樣量1 μl;程序升溫:130℃(1 min)→25℃/min→280℃(3 min).DBP 和 DEHP 的加標(biāo)回收率分別為:水樣100.5% 和93.2%;沉積物樣品87.0%和78.8%;菹草樣品95.6%和81.2%.

1.3.2 磷脂脂肪酸的分析 采用王愛麗[11]的方法提取分離1、15 和27 d 沉積物中的PLFAs.樣品分析采用Agilent 6890 N 型氣相色譜儀，5975 C 質(zhì)譜檢測器，HP-5 ms 5%石英毛細(xì)管柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm).選用全掃描方式進(jìn)行分析，升溫程序:初始溫度80℃，以30℃/min 升到150℃，再以3℃/min 升至230℃，保持1 min，再以10℃/min 升至280℃，保持2 min，總用時37 min.載氣為He，流量1.0 ml/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度為250℃，檢測器溫度為250℃，接口溫度為280℃，四級桿為150℃，離子源為230℃，EI 源70 eV.

根據(jù)文獻(xiàn)[7]將所有 PLFAs 之和作為總量;i15∶0、a15∶0、i16∶0、i17∶0、a17∶0 作為革蘭氏陽性菌的標(biāo)記PLFAs，其和作為革蘭氏陽性菌的總量;cy17∶0、cy19∶0、16∶1ω7、16∶1ω9、18∶1ω7、18∶1ω9 作為革蘭氏陰性菌的標(biāo)記PLFAs，其和作為革蘭氏陰性菌總量;革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、15∶0、17∶0 作為細(xì)菌的標(biāo)記PLFAs，其和作為細(xì)菌總的生物量;18∶2ω6，9 是真菌的標(biāo)記 PLFAs.

根據(jù)所測得的PLFA 數(shù)據(jù)計算多樣性指數(shù)(H)，計算公式為:

式中，Pi為樣品中某一種PLFA 的摩爾百分含量;S 為某一土壤樣品中所有PLFA 種類的數(shù)目.不同樣品的PLFA 數(shù)據(jù)使用SPSS(Statistics 20.0)進(jìn)行聚類分析，聚類方法為Hierarchical cluster analysis，采用Betweengroups linkage 方法.

2 結(jié)果

2.1 酞酸酯在微宇宙中的濃度變化

系統(tǒng)運(yùn)行過程中，水中DBP 濃度始終低于定量限(8 μg/L).DEHP 的濃度則由初始的65 μg/L和70 μg/L 逐漸降低，至第3 d 后低于定量限(8 μg/L)，兩個系統(tǒng)中 DEHP 濃度除第 3 d 外，均無顯著差異.

菹草莖葉中DBP 和DEHP 的濃度在實驗初始階段含量變化不顯著，第7 d 之后逐漸上升，系統(tǒng)運(yùn)行結(jié)束時含量分別升高133%和68%.整個實驗過程中，菹草體內(nèi)DEHP 的濃度平均是DBP的6 倍左右.實驗結(jié)束時測定了菹草根系DBP 和DEHP 濃度，分別為 73.9 和 75.9 mg/kg，約為莖葉含量的200 倍(圖1).

對照土和非根際土中DBP 濃度變化趨勢基本一致，11 d 后逐漸下降，結(jié)束時降解率為32.2% ～36.5%;根際土中DBP 濃度總體呈下降趨勢，0 ～15 d 波動較大，最終降解率達(dá)50.0%.對照組沉積物和非根際沉積物中DEHP 濃度變化趨勢總體一致，0 ～23 d 時無顯著變化，始終在9.80 ～10.31 mg/kg 范圍內(nèi)波動，23 d 后濃度開始明顯降低，實驗結(jié)束時對照組沉積物和非根際沉積物中DEHP 降解率達(dá)10.3% ～11.4%;根際沉積物中 DEHP 在 0 ～23 d 于 7.26 ～8.95 mg/kg 范圍內(nèi)波動，23 d 后迅速下降，降解率達(dá) 80.9%(圖 2).

圖1 菹草中DBP 和DEHP 的濃度Fig.1 Concentrations of DBP and DEHP in Potamogeton crispus L.

圖2 沉積物中DBP 和DEHP 的濃度Fig.2 Concentrations of DBP and DEHP in sediment samples

2.2 沉積物中磷脂脂肪酸的含量和聚類分析結(jié)果

經(jīng)測定，從沉積物中檢出12 ～17 種PLFA，包括飽和脂肪酸、支鏈脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，未檢測到環(huán)丙烷脂肪酸和帶羥基的脂肪酸.偶數(shù)碳飽和脂肪酸的相對含量為18.3% ～47.3%，是沉積物中含量最豐富的脂肪酸種類，其次是單不飽和脂肪酸，相對含量為17.9% ～43.2%.其中，飽和脂肪酸16∶0和 18∶0、單不飽和脂肪酸 18∶1ω9 和 18∶1ω6、雙不飽和脂肪酸 18∶2ω6，9 為優(yōu)勢脂肪酸.支鏈脂肪酸和奇數(shù)碳飽和脂肪酸的相對含量較低，在有些沉積物中未檢出(圖3).

圖3 沉積物中的PLFAs 組成Fig.3 Composition of PLFAs in sediment samples

在對照、非根際和根際沉積物中微生物總量、細(xì)菌總量、真菌總量以及革蘭氏陽性菌(G +)和革蘭氏陰性菌(G-)的含量這五個指標(biāo)總體上呈現(xiàn)出依次升高的趨勢(27 d 時G +除外，非根際濃度高于根際)，且隨著系統(tǒng)運(yùn)行時間的增長這3 種沉積物中微生物量均呈現(xiàn)不同程度的增加(表1).

表1 沉積物中PLFAs 含量(nmol/g(DW))及多樣性指數(shù)(H)Tab.1 Contents of PLFAs and biological divers ity index in sediment samples

將對照、非根際和根際沉積物中PLFA 進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明可聚為4 類(圖4):第1 d 的3 種沉積物(即對照、非根際和根際沉積物)和第15 d 的對照和非根際沉積物聚為一類;第27 d 對照和非根際沉積物為一類;第15 d 根際和第27 d 根際沉積物各單獨為一類.

3 討論

3.1 菹草對沉積物中微生物特征的影響

沉積物中微生物量在對照、非根際和根際沉積物中依次升高(表1)，說明種植菹草能夠顯著提高沉積物中微生物的數(shù)量.影響根際微生物量的因素較復(fù)雜:根系分泌物可為根際微生物提供碳源和能源，使得根際沉積物中微生物量要高于非根際沉積物[5];根系分泌物對微生物具有趨化作用，使微生物在根際聚集[12].非根際沉積物中微生物含量略高于對照組，這可能是由于菹草的促淤作用增加了非根際沉積物中的營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)了微生物的生長[13].

菹草對沉積物中微生物的群落結(jié)構(gòu)影響也很大.系統(tǒng)運(yùn)行初期(第1 d)，微生物群落結(jié)構(gòu)差異不大;隨著時間的增長，與非根際和對照沉積物相比，根際沉積物的微生物群落結(jié)構(gòu)變化較大(圖4)，表明植物的生長對沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響.這與陸生植物的研究結(jié)果一致[14].

圖4 沉積物中PLFA 數(shù)據(jù)聚類分析Fig.4 Cluster analysis of PLFA data from sediment samples

根據(jù)PLFA 數(shù)據(jù)計算微生物群落的多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，實驗過程中根際沉積物的生物多樣性高于非根際和對照組沉積物(表1)，表明根系分泌物不僅影響根際微生物的數(shù)量而且影響微生物群落的多樣性.

3.2 菹草對沉積物中酞酸酯消減作用的影響

系統(tǒng)運(yùn)行期間水體中DBP 和DEHP 濃度始終很低;菹草體內(nèi)這2 種PAEs 濃度第7 d 后逐漸升高，說明菹草可以從沉積物中富集這2 種污染物.通過計算，系統(tǒng)運(yùn)行結(jié)束時菹草對DBP 和DEHP 的富集量約增加0.15 和0.28 mg，不足沉積物中這2 種PAEs 去除量的1/8.可見，雖然菹草可以對污染物起一定的富集作用，但微生物的降解起主要作用.

系統(tǒng)運(yùn)行初期，根際、非根際和對照沉積物中這2 種PAEs 的濃度總體上差異并不顯著，此時微生物數(shù)量相對較少，群落結(jié)構(gòu)也較相似.這主要是系統(tǒng)運(yùn)行初期，沉積物中微生物需要一個增殖的過程，根際作用尚不顯著，因此使得沉積物中污染物濃度差異不大.系統(tǒng)運(yùn)行中后期，根際沉積物中2 種PAEs 濃度始終低于對照組和非根際沉積物，此時不僅根際沉積物中微生物量高于其他兩組，且微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了明顯變化.這是由于菹草根系分泌物為微生物提供了大量的碳源和營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)了根際微生物的生長[5]，同時改變了微生物的群落結(jié)構(gòu)[14]，形成的根際環(huán)境有效提高了PAEs 的降解速率.

沉積物中DBP 的濃度始終低于DEHP，并且在實驗過程中始終呈下降趨勢.據(jù)報道[15]，PAEs 的生物降解性由化合物分子大小決定，而這類化合物分子的大小由支鏈組成決定.與DEHP 相比，DBP 支鏈小，化合物空間位阻小，因此易于被微生物利用.DEHP 則在系統(tǒng)運(yùn)行23 d 前濃度變化不顯著，其原因可能是一方面DEHP 分子量大，較難降解，另一方面DEHP 的濃度較高，抑制了微生物的降解作用[16].23 d 后DEHP 濃度才開始明顯下降，尤其是根際沉積物中DEHP 的濃度在第27 d 迅速下降，而此時根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化也較大，與DEHP 的去除數(shù)據(jù)相吻合，說明微生物群落結(jié)構(gòu)是影響這類污染物降解的重要因素.

4 結(jié)論

1)PLFA 結(jié)果表明沉積物中微生物量和多樣性指數(shù)在根際、非根際和對照沉積物中依次降低.利用PLFAs數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，分析沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)，表明實驗中后期根際沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化.

2)實驗過程中水中DBP 和DEHP 濃度始終較低.菹草能夠富集沉積物中這2 種PAEs，但沉積物中這類物質(zhì)的降解主要依靠微生物的作用.根際沉積物中這2 種PAEs 的濃度始終低于對照組和非根際沉積物，與PLFA 的結(jié)果相吻合.計算得出，根際沉積物中DBP 和DEHP 的降解率分別為50.0%和80.9%，均高于對照組和非根際沉積物(DBP:32.2% ～36.5%;DEHP:10.3% ～11.4%).

菹草扎根于沉積物，能夠通過根際作用促進(jìn)根際微生物生長，改變微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高對這2 種PAEs 的降解能力.污染物在根際環(huán)境中的降解是一個復(fù)雜的過程，根系分泌物是產(chǎn)生根際效應(yīng)的關(guān)鍵因素，今后應(yīng)加強(qiáng)這方面的研究，為利用沉水植物修復(fù)受PAEs 污染沉積物提供科學(xué)依據(jù).

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